中藥材（石斛）鑒定特異性gDNA探針的篩選與應(yīng)用研究.pdf

1、本文以名貴中藥材石斛為研究材料，首先創(chuàng)立了一種在全基因組范圍篩選種特異性探針的“SSH-array”新技術(shù)，成功篩選到了一定數(shù)量的不同石斛種特異性探針。其次，建立了多重種特異性探針物種鑒定的“MSSP”新方法，對(duì)石斛樣本進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定。在“SSHarray”技術(shù)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)立了應(yīng)用于基因組DNA(gDNA)遺傳多態(tài)性研究的“DiversitySSH-array”新方法，有效地對(duì)6種石斛品種遺傳多態(tài)性進(jìn)行了研究并以此建立了6種石斛的遺傳親

2、源樹狀圖。此外，以我們獲得的種特異性探針為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)和篩選到兩個(gè)種特異性引物，為以PCR方法進(jìn)行物種鑒定提供了新的途徑。 本文所獲得的主要研究成果如下： 1.篩選gDNA種特異性探針的“SSH-array”新技術(shù)該方法是將抑制性差減雜交與基于尼龍膜微陣列雜交相結(jié)合。首先是用抑制性差減雜交獲得兩個(gè)品種之間的gDNA差異片段，然后用這些gDNA差異片段與由所有研究品種的gDNA制備成的微陣列雜交篩選到某一個(gè)品種的種特異性gD

3、NA片段。這些種特異性gDNA片段可以作為種特異性探針進(jìn)行物種鑒定。在該研究中，以迭鞘石斛(D.aurantiacumKerr)，金釵石斛(D.nobileLind.)，鐵皮石斛(D.officinaleKimuraetMigo)，鼓槌石斛(D.chrysotoxumLindl.).流蘇(D.fimbriatumHook.)為材料，對(duì)該方法的可行性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示：五種石斛的陽性克隆率最低78.1％，最高84.6％，陽性克隆率平均達(dá)

4、到82.3％，五種石斛種質(zhì)特異性探針的陽性探針篩選率最低7.9％，最高14.6％，平均達(dá)到12.1％，初步獲得了25個(gè)種特異性探針。結(jié)果表明該方法能夠有效地進(jìn)行g(shù)DNA種質(zhì)特異性探針篩選。 2.多重種質(zhì)特異性探針(multiplespecies-specificgDNAprobes，MSSP)的石斛鑒定用“SSH-array”方法從5種石斛中篩選到的14個(gè)種質(zhì)特異性探針點(diǎn)樣制備成微陣列，地高辛標(biāo)記的不同的商品石斛樣本和偽品的gD

5、NA與該微陣列雜交成功地對(duì)五種常見的石斛品種其中包括《中國藥典》收錄的三種石斛進(jìn)行了鑒定。對(duì)這些特異性探針的序列結(jié)構(gòu)、有效性及特征進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示出多重種質(zhì)特異性探針能夠準(zhǔn)確地鑒別不同的商品石斛樣本、混合材料中的靶樣本及偽品。。 3.研究遺傳多態(tài)性的“DiversitySSH-array”新方法基因組DNA的多態(tài)性在研究不同物種間的生物多樣性和遺傳特征追蹤等方面具有非常重要的意義?！癉iversitySSH-array”技術(shù)

6、首先通過抑制性差減雜交獲得隨機(jī)配對(duì)的兩個(gè)品種之間的差減片段，差減片段進(jìn)行克隆后，用這些差減克隆建立差減gDNA文庫。從差減gDNA文庫中隨機(jī)挑選差減克隆制備多樣性差減微陣列(DiversitySSH-array)。DiverstySSH-array與DIG標(biāo)記的待分析樣本的gDNA雜交獲得DNA多態(tài)性圖譜。六個(gè)石斛品種作為該項(xiàng)研究的材料，其中的四個(gè)品種作為Tester進(jìn)行抑制性差減雜交，共獲得617個(gè)陽性差減克隆，平均陽性克隆率80.3

7、％。四個(gè)品種兩兩比較的平均多態(tài)片段率高達(dá)42.4％，依據(jù)六個(gè)品種的多態(tài)圖譜建立了遺傳親源樹狀圖。結(jié)果表明DiversitySSHarray為研究不同樣本gDNA多態(tài)性及遺傳距離提供了一個(gè)低成本、有效的分析技術(shù)平臺(tái)。 4.石斛種特異性引物的篩選 我們以“SSH-array”方法從5種石斛中篩選到的10個(gè)種質(zhì)特異性探針序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了10對(duì)引物。其中的兩對(duì)引物能夠從它們所代表的樣本中擴(kuò)增出單一條帶而不能從其它四個(gè)品種樣本和