高機(jī)械指數(shù)超聲造影對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移影響的實驗研究.pdf

1、背景： 目前普遍認(rèn)為，腫瘤的生長存在兩個明顯不同的階段，即無血管的緩慢生長階段和有血管的快速生長階段。前者主要依靠彌散供氧，氧的最大彌散距離為150μm，當(dāng)腫瘤直徑超過1-2mm時，其繼續(xù)生長就需要血液供應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)實體瘤在缺少血管的情況下，生長擴(kuò)散受到了極大限制，在有血管的情況下，其瘤體增長迅速。正常人體的血管內(nèi)皮細(xì)胞倍增時間為一年，而腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞倍增時間僅四天。因此，阻斷腫瘤血供，從而抑制腫瘤的生長是目前研究

2、的熱點(diǎn)之一。 惡性腫瘤肝轉(zhuǎn)移的途徑主要是通過局部擴(kuò)散轉(zhuǎn)移、淋巴道轉(zhuǎn)移、血道轉(zhuǎn)移和癌細(xì)胞脫落形成種植轉(zhuǎn)移等。肝臟是人體最大的實質(zhì)性臟器，門靜脈及肝動脈雙重血液供應(yīng)的特點(diǎn)使其成為許多惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的主要部位。而結(jié)腸癌引起的肝轉(zhuǎn)移又是肝臟最常見的血道轉(zhuǎn)移方式。文獻(xiàn)報道約10％～25％的結(jié)直腸癌患者在接受原發(fā)灶的手術(shù)治療時已經(jīng)出現(xiàn)了肝轉(zhuǎn)移，另有約25％的患者在術(shù)后隨訪中發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，50％以上的結(jié)直腸癌最終發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，而肝轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌死亡

3、的主要因素之一。因此，抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移是提高結(jié)腸癌遠(yuǎn)期療效的關(guān)鍵問題之一。 近幾年，隨著超聲造影技術(shù)的發(fā)展和新型超聲造影劑的面市，關(guān)于微泡造影劑生物學(xué)效應(yīng)的問題也逐漸引起人們的重視，超聲造影在肝臟疾病診斷中得到了較廣泛的應(yīng)用，并取得了長足的進(jìn)步。超聲的物理特性和生物學(xué)效應(yīng)(熱效應(yīng)、空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)等)的運(yùn)用已滲透到了人體保健、疾病預(yù)防、疾病治療(包括體外碎石、止血、腫瘤切除等)、生物技術(shù)(如基因轉(zhuǎn)染)等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。超聲造影微泡不

4、僅作為一種人為的空化核，降低超聲的空化閾值，增強(qiáng)空化效應(yīng)，并減少產(chǎn)生空化效應(yīng)所需的超聲能量；超聲空化效應(yīng)本身對周圍組織細(xì)胞可產(chǎn)生各種生物學(xué)效應(yīng)，運(yùn)用高機(jī)械指數(shù)超聲造影對原發(fā)灶進(jìn)行間歇輻照，增強(qiáng)超聲空化效應(yīng)，可能對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抑制效應(yīng)。 目的： 本實驗在建立轉(zhuǎn)移性肝癌動物模型的基礎(chǔ)上，采用高機(jī)械指數(shù)超聲造影對其原發(fā)灶進(jìn)行間歇輻照，希望通過微泡增強(qiáng)的空化效應(yīng)，引起腫瘤組織及其周圍腫瘤微血管的破壞。并經(jīng)體外實驗觀察對腫瘤細(xì)

5、胞遷移運(yùn)動、增殖、凋亡、以及細(xì)胞微絲、微管等細(xì)胞骨架的影響，進(jìn)一步探討高機(jī)械指數(shù)超聲造影增強(qiáng)空化效應(yīng)，是否能夠?qū)е履[瘤肝轉(zhuǎn)移的數(shù)目及大小的改變，為抑制腫瘤肝臟轉(zhuǎn)移探索新的手段。 方法： 1.高機(jī)械指數(shù)超聲造影對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動物體內(nèi)的實驗研究： (1)轉(zhuǎn)移性肝癌動物模型的制備：結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10％滅活的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，取對數(shù)生長期的細(xì)胞作為實驗研究。研究對象為62只正常雄性SD大鼠(體重

6、200～250g)，其中10只在SD大鼠脾臟直接接種結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞后第2天、第4天及第6天分別脫頸處死，解剖SD大鼠肝臟，觀察轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目及大小，確定最佳輻照時間。 (2)實驗分組：隨機(jī)分為4組(對照組、微泡+超聲組、單純超聲組和單純微泡組)，每組12只。其中微泡+超聲輻照組的SD大鼠在接種結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞第4天時，用8％的硫化鈉給予SD大鼠腹部脫毛，1％戊巴比妥鈉40mg/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉，將SD大鼠仰臥固定于木板上

7、，經(jīng)尾靜脈注入SonoVue造影劑(1ml/kg)后，用高頻探頭尋找脾臟定位后，轉(zhuǎn)換為相控陣探頭，將探頭置于SD大鼠脾臟處，固定頻率為1.5MHz，機(jī)械指數(shù)為1.7，顯像深度固定在4cm。經(jīng)SD大鼠尾靜脈快速推注SonoVue造影劑(1ml/kg)，隨后推注1ml生理鹽水沖洗管道，輻照6s，間歇6s，共20次。 (3)將分組處理后的SD大鼠肝臟及脾臟采用HE染色，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查及透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)的變化。 2.高

8、機(jī)械指數(shù)超聲造影對惡性腫瘤影響的體外實驗： (1)結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10％滅活的新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，取對數(shù)生長期細(xì)胞，觀察細(xì)胞折光性強(qiáng)，將其分為4組(對照組、微泡+超聲組、單純超聲組和單純微泡組)，其中微泡+超聲組在采用ViVidFive型彩色多普勒超聲儀，調(diào)節(jié)超聲探頭頻率為1.5MHz，機(jī)械指數(shù)為1.7，顯像深度固定在4cm，用醫(yī)用膠帶將探頭環(huán)形纏繞呈現(xiàn)一凹槽，將耦合劑置于槽內(nèi)，使得培養(yǎng)板與耦合劑充分接

9、觸，超聲輻照6s，間歇6s，共20次。 (2)采用細(xì)胞遷移運(yùn)動試驗(Transwell法)和激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞遷移運(yùn)動能力及對結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞微絲、微管的影響。 (3)細(xì)胞增殖試驗(MTT法)檢測腫瘤細(xì)胞增殖活性的變化。 (4)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)腸癌細(xì)胞周期及凋亡，觀察G1期、S期及G2/G1期細(xì)胞比例的變化。 結(jié)果： 1.高機(jī)械指數(shù)超聲造影對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移影響的動物實驗研究顯示： (

10、1)將62只正常雄性SD大鼠，其中10只經(jīng)脾臟直接接種結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞后第2天、第4天及第6天分別脫頸處死，解剖SD大鼠肝臟，發(fā)現(xiàn)在接種結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞第4天即可見少數(shù)白色結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移灶，直徑在1-2mm左右，取此時為最佳輻照時間。余52只SD大鼠除4只因麻醉意外死亡，其余48只納入實驗研究，而其中41只于接種結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞14天后，解剖肝臟均發(fā)現(xiàn)直徑1～5mm的白色結(jié)節(jié)狀轉(zhuǎn)移灶，成功率為85.4％。 (2)分組處理后10天

11、，將SD大鼠脫頸處死，對照組肝臟可見多個局灶性灰白色的微小轉(zhuǎn)移灶、病灶直徑在2～5mm之間。微泡+超聲輻照組肝臟可見腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目明顯減少，直徑均在1～2mm之間。微泡+超聲輻照組與對照組比較腫瘤數(shù)目及大小顯著減少(P＜0.01)，單純超聲組及單純微泡組與對照組比較腫瘤數(shù)目、腫瘤大小差異沒有顯著意義(P＞0.05)。 (3)將對照組、微泡+超聲組、單純輻照組及單純微泡組分組處理后10天，解剖SD大鼠肝臟及脾臟作病理學(xué)檢查。

12、各組大鼠肝臟內(nèi)均有腫瘤細(xì)胞生長，瘤細(xì)胞多呈圓形或橢圓形，呈團(tuán)狀分布，但在微泡+輻照組肝臟腫瘤細(xì)胞明顯減少，脾臟組織內(nèi)出現(xiàn)大片出血壞死及明顯血栓形成，對照組、單純輻照組及單純微泡組的血栓數(shù)量明顯少于微泡+超聲組。 (4)透射電鏡觀察脾臟組織超微結(jié)構(gòu)的改變：對照組透射電鏡可見腫瘤細(xì)胞核大，胞漿和胞核比例減小，線粒體較多，未見腫脹。內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，之間連接緊密，線粒體正常。微泡+超聲組透射電鏡可見明顯的超微結(jié)構(gòu)的破壞，腫瘤細(xì)胞除具有

13、對照組特點(diǎn)之外，線粒體明顯腫脹，呈球狀。內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)多樣，緊密連接斷開，線粒體腫大。單純超聲組、單純微泡組與對照組之間無顯著差別。 2.高機(jī)械指數(shù)超聲造影對結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞遷移運(yùn)動、增殖及凋亡的影響： (1)采用Transwell法發(fā)現(xiàn)，對照組Lovo細(xì)胞數(shù)發(fā)生明顯遷移，而進(jìn)行微泡+超聲輻照后Lovo細(xì)胞遷移數(shù)明顯減少(P＜0.01)，微泡+超聲輻照組可見大量懸浮不透亮的死亡細(xì)胞；而單純超聲組細(xì)胞遷移數(shù)和單純微泡組的細(xì)

14、胞遷移數(shù)目與對照組比較，無顯著差異(P＞0.05)。 (2)用激光共聚焦顯微鏡檢測各組，細(xì)胞內(nèi)微絲蛋白F-actin的表達(dá)，結(jié)果顯示：對照組微管染色表現(xiàn)為細(xì)胞致密的絲狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，向細(xì)胞邊緣呈放射性延伸；單純超聲組與單純微泡組與對照組無明顯差別；微泡+超聲組微管表達(dá)較對照組減弱、稀疏，網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)主要沿細(xì)胞長軸排列。對照組細(xì)胞微絲染色表現(xiàn)為細(xì)胞致密網(wǎng)絡(luò)狀細(xì)絲樣結(jié)構(gòu)，向四周伸出許多細(xì)短的毛刺狀突起，有明顯的拉絲狀和方向性；單純超聲組與

15、單純超聲微泡組與對照組無明顯差別；微泡+超聲組Lovo細(xì)胞胞質(zhì)中部的網(wǎng)絡(luò)狀細(xì)絲明顯減少，熒光暗淡，細(xì)短的毛刺狀突起明顯減少。 (3)MTT法檢測細(xì)胞增殖活性結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞PI增殖指數(shù)明顯多于微泡+超聲組(P＜0.01)，而單純超聲組細(xì)胞增殖數(shù)和單純微泡組的細(xì)胞增殖指數(shù)與對照組比較，無顯著差異(P＞0.05)。 (4)流式細(xì)胞儀檢測各組結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞周期及凋亡的改變，結(jié)果顯示：對照組G1期細(xì)胞比例顯著降低(P＜0

16、.01)，而S期細(xì)胞比例顯著增高(P＜0.01)；單純超聲組和單純微泡組與對照組各細(xì)胞周期的比例無顯著差異(P＞0.05)；與對照組相比，微泡+超聲輻照組G1期細(xì)胞比例顯著增高(P＜0.01)，S期細(xì)胞比例顯著降低，且凋亡峰與對照組相比較明顯增高(P＜0.01)。 結(jié)論： 1.高機(jī)械指數(shù)超聲造影能夠引起轉(zhuǎn)移性肝癌的數(shù)目、大小發(fā)生改變，抑制腫瘤肝轉(zhuǎn)移； 2.高機(jī)械指數(shù)超聲造影能夠引起原發(fā)腫瘤組織壞死，促進(jìn)腫瘤內(nèi)部及