氟、砷及其聯(lián)合染毒對大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　我國是世界上地方性氟中毒和砷中毒發(fā)病最廣、病情最重的國家之一。飲水型氟中毒和砷中毒病區(qū)，是我國這兩種地方病最主要的病區(qū)類型。近年發(fā)現(xiàn)我國山西、新疆、內(nèi)蒙等地存在飲水型氟砷聯(lián)合中毒的病區(qū)，高氟與高砷并存，增加了對人群健康影響的復(fù)雜性，對病區(qū)兒童生長發(fā)育、智力的影響已引起廣泛關(guān)注。
　　研究表明過量氟、砷均可通過胎盤屏障或血腦屏障而在腦組織中蓄積，影響兒童不同時期的腦發(fā)育和神經(jīng)遞質(zhì)的合成與分泌、神經(jīng)信息的傳遞，從而損

2、傷兒童智力和學(xué)習(xí)記憶能力。來自世界不同氟中毒、砷中毒病區(qū)的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)兒童長期飲用高氟水或高砷水可引起智力下降，損害學(xué)習(xí)記憶能力，同時也發(fā)現(xiàn)高砷高氟并存病區(qū)兒童的生長發(fā)育和智力受到一定程度的損害。但到目前為止，氟、砷損害學(xué)習(xí)記憶的分子機(jī)制尚未闡明。本研究以與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的海馬、大腦皮質(zhì)組織為靶點(diǎn)，研究氟、砷及其聯(lián)合暴露對學(xué)習(xí)記憶功能、海馬和大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響，同時對海馬、大腦皮質(zhì)組織一氧化氮(nitricoxi

3、de，NO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)，谷氨酸(glutamate，Glu)及其Ⅰ組代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptors，mGluRs)的基因和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測分析，探討氟、砷及聯(lián)合作用損害學(xué)習(xí)記憶的分子機(jī)制，揭示氟與砷的交互作用方式，為氟、砷及其聯(lián)合中毒的防治提供理論依據(jù)和新思路。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)動物與分組
　　

4、健康、初斷乳SPF級Sprague-Dawley大鼠96只，雌:雄為1∶1，體重50～70g。標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)，保持室溫(24±1)℃，相對濕度在50-65％，自由飲食。適應(yīng)性喂養(yǎng)觀察1周后，將大鼠隨機(jī)分為對照組、氟處理組、砷處理組和氟砷聯(lián)合組，每組24只，雌雄各半。氟處理組大鼠自由飲用120 mg/L氟化鈉(NaF)水溶液;砷處理組大鼠自由飲用70 mg/L亞砷酸鈉(NaAsO2)水溶液;氟砷聯(lián)合組大鼠自由飲用120 mg/L

5、NaF和70 mg/L NaAsO2的混合水溶液;對照組大鼠自由飲用蒸餾水。各組染毒時間均為3個月，染毒期間四組大鼠均自由飲水、正常攝食。染毒期滿后進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力測試。測試結(jié)束后處死動物，組織取材。
　　二、研究內(nèi)容和方法
　?。ㄒ唬└鹘M大鼠血液、海馬和大腦皮質(zhì)組織氟和砷含量測定
　　分別采用酶標(biāo)儀-氟試劑分光光度法和氫化物原子熒光光度法檢測血液、海馬和大腦皮質(zhì)組織中氟和砷含量。
　　（二）各組大鼠海馬和大腦皮

6、質(zhì)組織神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的變化
　　常規(guī)制做電鏡標(biāo)本，在透射電子顯微鏡下觀察氟、砷及其聯(lián)合染毒大鼠海馬、大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。
　?。ㄈ└鹘M大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的評價
　　采用曠場試驗(yàn)和Morris水迷宮評價大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。
　　（四）各組大鼠血清、海馬和大腦皮質(zhì)組織氧化損傷的檢測
　　制備10％的海馬和大腦皮質(zhì)組織勻漿，按照試劑盒說明檢測大鼠血清、海馬、大腦皮質(zhì)神經(jīng)組織總抗氧化能力(T-AOC)、S

7、OD酶和GSH-Px酶活力和MDA水平。
　?。ㄎ澹└鹘M大鼠血清、海馬和大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的檢測
　　提取海馬、大腦皮質(zhì)組織總蛋白，采用Western blot方法檢測Caspase-3、B細(xì)胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma2，Bcl-2）和Bcl-2相關(guān)的Ⅹ蛋白(Bcl-2 associatedⅩ protein，Bax)蛋白表達(dá)。
　?。└鹘M大鼠血清、海馬和大腦皮質(zhì)組織NO和NOS酶活力、谷氨酸水

8、平的檢測
　　制備10％的海馬和大腦皮質(zhì)組織勻漿，按照試劑盒說明檢測大鼠血清、海馬、大腦皮質(zhì)神經(jīng)組織一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)的活力和谷氨酸(Glu)水平。
　?。ㄆ撸└鹘M大鼠海馬和大腦皮質(zhì)組織Ⅰ組mGluRs受體亞基mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)檢測
　　提取組織總RNA，采用Reverse Transcription-PCR(RT-PCR)法檢測氟、砷及其聯(lián)合暴露對大鼠腦組織mGluR1和mGluR5基因表達(dá)的

9、影響。提取組織總蛋白，采用Western blot法檢測氟、砷及其聯(lián)合暴露對大鼠腦組織mGluR1和mGluR5蛋白表達(dá)的影響。
　?。ò耍┙y(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果以(x)±s表示。對于不呈現(xiàn)正態(tài)分布和方差不齊的數(shù)據(jù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換或取倒數(shù)后使其正態(tài)和方差齊。運(yùn)用SAS8.2(SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采

10、用LSD方法。
　　結(jié)果：
　　一、大鼠血液、海馬和大腦皮質(zhì)組織氟和砷含量測定
　　氟處理組和氟砷聯(lián)合組大鼠血清、海馬和大腦皮質(zhì)組織氟含量均明顯高于對照組和砷處理組（P均＜0.01）。砷處理組和氟砷聯(lián)合組大鼠血液、海馬和大腦皮質(zhì)組織砷含量均明顯高于對照組和氟處理組（P均＜0.01）。四組大鼠海馬和大腦皮質(zhì)組織的氟、砷含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　二、氟、砷及其聯(lián)合染毒大鼠海馬和大腦皮質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的變化

11、　　對照組大鼠海馬和大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞核膜清晰完整，核內(nèi)異染色質(zhì)及常染色質(zhì)分布正常，核周線粒體等細(xì)胞器形態(tài)正常;突觸前膜、后膜、突觸間隙結(jié)構(gòu)正常，胞漿內(nèi)突觸小泡，線粒體內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)完整，微管及微絲正?？梢?。氟、砷及其聯(lián)合染毒大鼠海馬和大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞均發(fā)生了程度不等的病理變化，主要表現(xiàn)在細(xì)胞皺縮，核變形，核周部分線粒體腫脹、空化、脊減少或消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)大呈池狀;突觸前膜胞漿內(nèi)突觸小泡，線粒體嵴結(jié)構(gòu)不完整，突觸間隙擴(kuò)大，突觸后膜線粒體腫

12、脹、空化等。
　　三、氟、砷及其聯(lián)合染毒對大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響
　?。ㄒ唬┓?、砷及其聯(lián)合染毒對大鼠在新環(huán)境中探究行為的影響
　　氟砷聯(lián)合組大鼠曠場試驗(yàn)總得分明顯低于對照組、氟處理組和砷處理組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。氟、砷處理組和氟砷聯(lián)合組大鼠的中央格停留時間均明顯高于對照組（P均＜0.01）。四組大鼠曠場試驗(yàn)修飾次數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　（二）氟、砷及其聯(lián)合染毒對大鼠空間學(xué)習(xí)

13、記憶功能的影響
　　與對照組比較，氟、砷處理組和氟砷聯(lián)合組大鼠的Morris水迷宮逃逸潛伏期和首次達(dá)平臺時間均明顯升高（P均＜0.01），第三象限時間和穿越平臺次數(shù)均明顯降低（P均＜0.01）。這四個指標(biāo)在氟、砷處理組和氟砷聯(lián)合組兩兩組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　四、氟、砷及其聯(lián)合染毒對大鼠血清、海馬和大腦皮質(zhì)組織氧化損傷的影響
　?。ㄒ唬┓⑸榧捌渎?lián)合染毒對總抗氧化能力(T-AOC)的影響
　

14、　與對照組比較，氟、砷處理組和氟砷聯(lián)合組大鼠的血清、海馬和大腦皮質(zhì)組織T-AOC(total antioxidant capability，T-AOC)水平均顯著降低;與砷處理組比，氟處理組和氟砷聯(lián)合組大鼠的血清T-AOC水平較低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)。
　?。ǘ┓⑸榧捌渎?lián)合染毒對總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力的影響
　　與對照組比較，砷處理組和氟砷聯(lián)合組大鼠的血清T-SOD酶活力均明顯降低（P均＜

15、0.01），氟處理組大鼠的血清T-SOD酶活力較低，差異具有臨界顯著性（P=0.053）。四組大鼠海馬組織T-SOD酶活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與對照組、氟處理組和氟砷聯(lián)合組比較，砷處理組大鼠大腦皮質(zhì)T-SOD酶活力較低(P＜0.01, P＜0.05,P＜0.05)。
　?。ㄈ┓?、砷及其聯(lián)合染毒對谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力的影響
　　與對照組比較，砷處理組和氟砷聯(lián)合組大鼠的血清GSH-Px酶的活力均

16、較低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）;與氟處理組比較，砷處理組和氟砷聯(lián)合組大鼠的血清GSH-Px酶的活力均較低（P＜0.01和P＜0.05）。砷處理組大鼠的海馬GSH-Px酶的活力低于對照組、氟處理組和氟砷聯(lián)合組（P均＜0.01）。與對照組比較，氟、砷處理組和氟砷聯(lián)合組大鼠的大腦皮質(zhì)GSH-Px酶的活力均較低(P＜0.05，P＜0.01和＜0.05)。
　?。ㄋ模┓?、砷及其聯(lián)合染毒對丙二醛(MDA)含量的影響
　　與

17、對照組比較，氟、砷處理組和氟砷聯(lián)合組大鼠的血清MDA水平明顯升高(P＜0.01，P＜0.05和P＜0.05)。氟砷聯(lián)合組大鼠海馬MDA水平明顯高于對照組(P＜0.01)，氟處理組(P＜0.05)和砷處理組(P＜0.05)。氟處理組和氟砷聯(lián)合組大鼠大腦皮質(zhì)組織MDA含量均明顯高于對照組;與砷處理組比較，氟處理組大鼠大腦皮質(zhì)MDA水平較高(P＜0.05)。
　　五、氟、砷及其聯(lián)合染毒對大鼠海馬和大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響
　?。?/p>

18、一）氟、砷及其聯(lián)合染毒對Caspase-3凋亡蛋白表達(dá)的影響
　　四組大鼠海馬和大腦皮質(zhì)組織Caspase-3蛋白表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?。ǘ┓?、砷及其聯(lián)合染毒對海馬組織Bcl-2和Bax凋亡蛋白表達(dá)的影響
　　氟、砷處理組大鼠海馬組織凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量均低于對照組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而氟砷聯(lián)合組大鼠凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量明顯低于對照組、氟和砷處理組(P＜0.01，P＜0.01和＜0.05)。與對照組比

19、較，氟、砷處理組和聯(lián)合組大鼠海馬組織凋亡蛋白Bax的表達(dá)均明顯升高，氟砷聯(lián)合組升高最明顯(P＜0.05，P＜0.01和P＜0.01);砷處理組和氟砷聯(lián)合組的Bax表達(dá)水平均高于氟處理組(P＜0.05和P＜0.01)。與對照組比較，氟、砷處理組和氟砷聯(lián)合組凋亡蛋白Bcl-2/Bax的表達(dá)比值均明顯降低，氟砷聯(lián)合組降低最明顯(P＜0.05，P＜0.01和P＜0.01)。
　?。ㄈ┓⑸榧捌渎?lián)合染毒對大腦皮質(zhì)組織Bcl-2和Bax凋亡

20、蛋白表達(dá)的影響
　　氟、砷處理組和氟砷聯(lián)合組大鼠大腦皮質(zhì)組織Bcl-2蛋白表達(dá)均低于對照組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對照組比，氟、砷處理組和聯(lián)合組大鼠大腦皮質(zhì)組織Bax蛋白表達(dá)量均顯著升高（P均＜0.05）。氟、砷處理組和氟砷聯(lián)合組大鼠的Bcl-2/Bax表達(dá)比值均明顯低于對照組，尤以氟砷聯(lián)合組最明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01和P＜0.01)。
　　六、氟、砷及其聯(lián)合染毒對大鼠血清、海馬和大腦皮質(zhì)組織N

21、O、NOS酶活力、Glu的影響
　?。ㄒ唬┓?、砷及其聯(lián)合染毒對大鼠血清、海馬和大腦皮質(zhì)組織NO和NOS酶活力的影響
　　氟處理組和氟砷聯(lián)合組大鼠血清NO水平均低于對照組(P＜0.05和P＜0.01)。與對照組比，氟、砷處理組和氟砷聯(lián)合組大鼠海馬組織NO水平均明顯降低(P＜0.01,P＜0.05和P＜0.05)。
　　氟、砷處理組和氟砷聯(lián)合組大鼠血清、海馬NOS酶活力均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。砷處理組大鼠大腦

22、皮質(zhì)組織NOS酶活力明顯低于對照組和氟砷聯(lián)合組（P＜0.01和P＜0.05）。
　?。ǘ┓?、砷及其聯(lián)合染毒對大鼠血清、海馬和大腦皮質(zhì)組織Glu含量的影響
　　與對照組比，氟、砷處理組和氟砷聯(lián)合組大鼠血清、海馬和大腦皮質(zhì)組織Glu水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。氟、砷處理組和氟砷聯(lián)合組大鼠血清、海馬和大腦皮質(zhì)組織Glu水平兩兩組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　七、氟、砷及其聯(lián)合染毒對大鼠海馬和大腦皮質(zhì)組織Ⅰ組mGlu

23、RsmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響
　　與對照組比，砷處理組大鼠海馬組織mGluR1 mRNA表達(dá)升高(P＜0.05)，而氟砷聯(lián)合組大鼠海馬mG1uR1 mRNA表達(dá)均明顯低于氟、砷處理組(P＜0.05和P＜0.01)。與對照組比，砷處理組和氟砷聯(lián)合組大鼠大腦皮質(zhì)組織mGluR1 mRNA表達(dá)均顯著升高（P均＜0.01），尤以氟砷聯(lián)合組明顯，且聯(lián)合組mGluR1 mRNA表達(dá)顯著高于氟、砷處理組(P＜0.01和P＜0.05)。

24、　　與對照組比，砷處理組、氟砷聯(lián)合組大鼠海馬mGluR5 mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05和P＜0.01);氟砷聯(lián)合組大鼠海馬組織mGluR5 mRNA表達(dá)顯著低于氟處理組大鼠（P＜0.05）。與對照組比，氟、砷處理組大鼠大腦皮質(zhì)組織mGluR5 mRNA表達(dá)均降低，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而氟砷聯(lián)合組mGluR5 mRNA表達(dá)顯著低于對照組、氟和砷處理組（P均＜0.01）。
　　氟砷聯(lián)合組大鼠海馬組織mGluR5蛋白質(zhì)表達(dá)量明顯

25、低于對照組、氟處理組和砷處理組（P均＜0.01）。與對照組比，砷處理組和氟砷聯(lián)合組大鼠大腦皮質(zhì)mGluR5的蛋白表達(dá)量降低(P＜0.05和P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1、慢性氟、砷及其聯(lián)合暴露均可影響大鼠在新環(huán)境中的探究行為和認(rèn)知能力，使大鼠學(xué)習(xí)和記憶的獲取能力降低，損害大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。
　　2、慢性氟、砷及其聯(lián)合暴露可引起大鼠海馬、大腦皮質(zhì)組織氧化性損傷，可能與氟、砷及其聯(lián)合作用所致大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷有關(guān)

26、。
　　3、慢性氟、砷及其聯(lián)合暴露均使大鼠海馬和大腦皮質(zhì)組織Bax凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2/Bax的表達(dá)比值降低;氟砷聯(lián)合暴露下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)的作用高于單獨(dú)氟或砷暴露，氟與砷存在協(xié)同作用。氟、砷誘導(dǎo)Bax和Bcl-2凋亡蛋白的變化可能參與了氟砷損害學(xué)習(xí)記憶的分子機(jī)制。
　　4、慢性氟、砷及其聯(lián)合暴露均可降低大鼠海馬組織NO水平和NOS酶活力，而對大腦皮質(zhì)組織NO水平?jīng)]有影響。氟、砷降低腦組織NO水平和NOS酶活力可