丙泊酚對HEK-293細(xì)胞中表達(dá)的hERG鉀通道及其無義突變體Q738X的抑制作用.pdf

1、研究背景及目的
　　 長QT綜合癥(long QT syndrome,LQTS)可分為先天遺傳性和后天獲得性LOTS二類。先天性LQTS是由于編碼心肌細(xì)胞離子通道的基因突變導(dǎo)致相應(yīng)離子通道蛋白功能發(fā)生異常所致。目前已知的先天性LQTS的相關(guān)基因至少有十種,分別為LQT1～LQT10。其中LQT2是由于編碼快速激活的延遲整流鉀通道(rapidactivating delayed rectifier K+channel,IKr)的h

2、ERG基因(human ether-a-go-go-related gene,hERG)發(fā)生突變所致,IKr道是形成心肌細(xì)胞動作電位復(fù)極3期的主要離子通道,對維持和決定動作電位時程的長短具有重要意義。最近報道在一日本遺傳性LQTS家系中發(fā)現(xiàn)了hERG基因的一個新的突變位點(diǎn)Q738X,對該基因突變導(dǎo)致hERG鉀通道功能的改變迄今國內(nèi)外尚未見報道。
　　 獲得性LQTS主要是由于藥物引起,藥物主要通過兩種機(jī)制作用于hERG鉀通道:①

3、直接抑制hERG鉀通道,藥物多與hERG鉀通道S6區(qū)域的兩個芳香族氨基酸Y652和F656具有高的親和力,引起心肌細(xì)胞復(fù)極3期K+外流減少；②影響hERG蛋白的運(yùn)輸過程,造成細(xì)胞膜表面的bERG蛋白數(shù)量減少。
　　 丙泊酚(propofol)又名異丙酚,是一種快速強(qiáng)效的全身麻醉劑,由丙泊酚引起的心電圖QT間期延長,導(dǎo)致發(fā)作性暈厥、心臟猝死的心律失常事件時有發(fā)生。關(guān)于丙泊酚對QT間期影響的報道結(jié)果不一,一些研究認(rèn)為丙泊酚能延長QT

4、間期,相反,有些報道認(rèn)為丙泊酚不影響甚至縮短QT間期。然而,在這些報道中丙泊酚常和其它藥物同時使用,很難判定是丙泊酚單獨(dú)作用的結(jié)果。我們假設(shè)丙泊酚對QT間期的影響及其機(jī)制可能與hERG鉀通道的抑制有關(guān)。因此,本
　　 實驗?zāi)康?①突變體Q738X-hERG的功能鑒定；②探討丙泊酚對野生型(widetype,WT)hERG鉀通道和共轉(zhuǎn)染型WT/Q738X-hERG鉀通道的影響；③丙泊酚對hERG鉀通道作用機(jī)制的探討,為臨床合理化和

5、個體化用藥提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.PCR定點(diǎn)突變Q738X、Y652A和F656C-hERG:采用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行Q738X,Y652A和F656C突變,經(jīng)DNA測序驗證突變成功。
　　 2.細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時轉(zhuǎn)染:人胚腎上皮細(xì)胞(human anbryomc kidney cell line,HEK-293細(xì)胞)在含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。采用磷酸鈣沉淀或脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法進(jìn)行

6、瞬時轉(zhuǎn)染。根據(jù)實驗要求,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒包括:①野生型WT-hERG;②突變型Q738X、Y652A和F656C-hERG；③共轉(zhuǎn)染型:WT/Q738X-hERG；④對照組WT-hERG和空白質(zhì)粒PBI。
　　 3.全細(xì)胞膜片鉗記錄hERG鉀通道電流:尋找表達(dá)有綠色熒光的單個HEK-293細(xì)胞,采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),選用不同的實驗方案,分別記錄野生型WT、突變型Q738X、共轉(zhuǎn)染型WT/Q738X和對照組的hERG鉀通道電流和其動力學(xué)特

7、征變化,以及丙泊酚對野生型WT、突變型Y652A和F656C和共轉(zhuǎn)染型WT/Q738X-hERG鉀通道電流和其動力學(xué)特征的變化。
　　 4.Western blot檢測hERG蛋白的表達(dá):酶解收集蛋白,BCA法測蛋白含量,RIPA裂解蛋白,10％的SDS-PAGE凝膠電泳,PVDF轉(zhuǎn)膜,5％脫脂牛奶室溫封閉,抗hERG抗體(1:200),4℃孵育過夜,HRP標(biāo)記的二抗(1:10000),室溫孵育1 h,ECL顯色。通過Quant

8、ity one軟件分析每條帶的灰密度值,與自身內(nèi)參β-actin條帶的灰密度相比,對每條帶進(jìn)行半定量分析。
　　 5.雙重細(xì)胞免疫熒光:分別觀察轉(zhuǎn)染W(wǎng)T、Q738X和WT/Q738X-hERG的HEK-293細(xì)胞上hERG蛋白的定位情況以及丙泊酚對WT-hERG蛋白定位的影響,轉(zhuǎn)染36～48 h后4％多聚甲醛固定細(xì)胞,0.1％Triton X-100透化,2％牛血清白蛋白封閉,隨后加入兔源抗hERG蛋白抗體和雞源抗肌鈣網(wǎng)蛋白抗體

9、,4℃孵育過夜,次日加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG和Alexa fluor633標(biāo)記的山羊抗雞IgC的二抗,封片劑封片。
　　 6.激光共聚焦技術(shù)
　　 將細(xì)胞免疫熒光染色的HEK-293細(xì)胞進(jìn)行激光共聚焦定位,FITC(綠色)和Alexa fluor(紅色)分別用波長488 nm的氬離子激光和633 nm的氦氖離子激光激發(fā)。
　　 7.統(tǒng)計學(xué)處理
　　 所有數(shù)值用mean±S.E.M表示,使用puls

10、e8.67軟件記錄和分析通道電流,采用SPSS13.0和Origin6.0軟件來擬合曲線和制圖,加藥前后采用配對t檢驗,組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1.突變體Q738X-hERG的功能鑒定
　　 1.1突變體Q738X-hERG電流的記錄
　　 將轉(zhuǎn)染有野生型WT-hERG的HEK-293細(xì)胞進(jìn)行電生理記錄,顯示出典型的bERG鉀電流,由時間依賴性電流和尾

11、電流兩部分組成。而在單獨(dú)表達(dá)有突變型Q738X-hERG的HEK-293細(xì)胞中記錄不到電流。將WT-hERG和Q738X-hERG(各2μg)共轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞中時,雖可記錄到hERG鉀電流,其電流圖形也與WT-hERG電流相似,但其電流幅度明顯低于WT-hERG(4μg)而與WT-hERG(2μg)電流大小相似。WT-hERG(4μg)、WT-hERG(2μg)和WT/Q738X(各2μg)的尾電流幅度依次為59.9±3.0、

12、32.2±1.7(P<0.05vs4μg WT-hERG)和26.2±3.5 pA/pF(P<0.05 vs4μg WT-hERG)；通過對WT/Q738X的動力學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)Q738X突變不改變hERG鉀通道的動力學(xué)特征(包括激活、失活和去活過程)。
　　 1.2突變體Q738X的運(yùn)輸障礙
　　 Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染野生型WT-hERG的HEK-293細(xì)胞中可以檢測到二條蛋白質(zhì)條帶(135和155 KDa

13、),而突變體Q738X-hERG只出現(xiàn)135 KDa一個條帶,共轉(zhuǎn)染型WT/Q738X-hERG雖出現(xiàn)135和155 KDa二條蛋白質(zhì)條帶,但其155KDa的條帶較弱。通過Quantity one軟件分析每條帶的灰密度值,對每條帶進(jìn)行半定量分析。結(jié)果顯示,共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T/Q738X-hERG雖有成熟的hERG蛋白(155 KDa)的形成,但是表達(dá)量少于WT-hERG(P<0.01)。說明Q738X的突變影響hERG蛋白的運(yùn)輸,使其到達(dá)細(xì)胞膜

14、表面有功能的hERG蛋白數(shù)量減少。
　　 雙重細(xì)胞免疫熒光染色后經(jīng)激光共聚焦定位顯示:轉(zhuǎn)染有WT-hERG的HEK-293細(xì)胞,其綠色熒光主要分布在細(xì)胞膜上,與ER marker(紅光)共定位后,雖有部分重疊,但膜上的綠色熒光仍然很清楚；而轉(zhuǎn)染有突變體Q738X-hERG的HEK-293細(xì)胞,其綠色熒光主要分布在胞漿中,與ER marker共定位后,完全重合,說明突變體Q738X-hERG蛋白分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中；當(dāng)將WT和Q738X

15、共轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞時,雖在胞漿處有部分重疊,但膜上仍有綠色熒光。
　　 2.丙泊酚對WT-hERG鉀通道的影響
　　 2.1丙泊酚對WT-hERG鉀通道的直接影響
　　 丙泊酚濃度依賴性的抑制WT-hERG鉀通道,當(dāng)濃度為0.01、0.1、1、3、10、30、100、300、1000和3000μM時,丙泊酚對WT-hERG鉀通道的抑制率依次為3.8±2.4％、13.9±7.9％、17.0±5.5％、23.

16、2±5.0％、29.8±4.9％、43.7±5.4％、58.2±4.8、66.4±7.5％、71.2±4.3％和84.3±4.1％,丙泊酚抑制WT-hERG鉀通道的IC50值為60.9±6.4μM；
　　 使用“尾電流包裹”的實驗方法觀察10μM丙泊酚對WT-hERG鉀通道的時間依賴性,結(jié)果顯示,隨著刺激時程的延長,丙泊酚對WT-hERG鉀通道尾電流的抑制程度增加,但大約在1500 ms之后,抑制率達(dá)到43.6±3.8％不再有明

17、顯增加,說明丙泊酚對WT-hERG鉀通道的抑制具有時間依賴性。
　　 觀察10μM丙泊酚對WT-hERG鉀電流的頻率依賴性,在頻率為1 Hz時,加藥后對WT-hERG鉀電流的抑制率為71.0±2.1％；在頻率為0.2 Hz時,其抑制率為69.4±2.3％。盡管頻率不同,但加藥后的電流抑制率經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理,無顯著差異(P>0.05)。說明丙泊酚對WT-hERG鉀電流的抑制無頻率依賴性。
　　 通過觀察10μM丙泊酚對WT-h

18、ERG鉀通道動力學(xué)的影響,表明10μM丙泊酚對其動力學(xué)特性(包括激活、失活和去活)均無影響。
　　 為了解丙泊酚和hERG基因S6區(qū)域的兩個位點(diǎn)Y652和F656是否具有高親和力,本實驗觀察了丙泊酚對突變體Y652A和F656C的作用,結(jié)果顯示,300μM的丙泊酚對WT-hERG鉀通道的抑制率為66.3±7.5％,而對Y652A-hERG鉀通道的抑制率僅為21.3±4.1％(P<0.05 vs WT-hERG),丙泊酚抑制Y65

19、2A-hERG鉀通道電流的IC50值為2871.8±351.9μM；當(dāng)丙泊酚的濃度為100、300、1000和3000μM時,其對WT-hERG鉀通道電流分別抑制了51.0±5.2％、62.4±5.9％、88.4±3.3％和94.7±2.1％；對F656C-hERG鉀通道電流分別抑制了8.3±4.5％、21.2±6.3％、39.5±6.7％和45.0±8.3％(P<0.05 vs WT-hERG),可見Y652A和F656C的突變均削弱

20、了丙泊酚抑制WT-hERG鉀通道的能力。
　　 2.2丙泊酚對WT-hERG蛋白運(yùn)輸?shù)挠绊?br>　　 經(jīng)Western blot分析和激光共聚焦結(jié)果顯示丙泊酚對WT-hERG蛋白的表達(dá)和定位無影響。
　　 3.丙泊酚對WT/Q738X-hERG鉀通道的影響
　　 丙泊酚濃度依賴性的抑制WT/Q738X-hERG鉀通道,當(dāng)濃度為0.1、1、3、10、30、100和1000μM時,丙泊酚依次對WT/Q738X-h

21、ERG鉀通道的抑制率為2.9±4.9％、11.6±3.8％、33.7±3.2％、48.9±2.5％、55.8±3.8％、80.1±2.9％和87.5±2.9％,丙泊酚抑制WT/Q738X-hERG鉀通道的IC50值為14.2±2.8μM,但丙泊酚不改變WT/Q738X-hERG鉀通道的激活和失活特性。
　　 結(jié)論：
　　 1.突變體Q738X可導(dǎo)致hERG蛋白功能的喪失,對野生型WT-hERG鉀通道無負(fù)顯性抑制,屬于運(yùn)輸