捕食線蟲(chóng)性真菌的分離鑒定及少孢節(jié)叢孢菌黏附分子與線蟲(chóng)相互作用初步研究.pdf

1、動(dòng)物消化道線蟲(chóng)病是嚴(yán)重危害畜牧業(yè)發(fā)展的寄生蟲(chóng)病,每年給畜牧業(yè)造成巨大的損失。目前,該病的防治主要依賴于化學(xué)藥物。然而,隨著化學(xué)藥物對(duì)線蟲(chóng)防控弊端的日益凸現(xiàn),目前需尋求一種動(dòng)物--環(huán)境友好型線蟲(chóng)病防控方法。近年來(lái),利用線蟲(chóng)的天敵--食線蟲(chóng)性真菌對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行生物防控備受關(guān)注。少孢節(jié)叢孢菌作為捕食線蟲(chóng)性真菌代表種之一,隨著對(duì)其全基因組的測(cè)序成功和部分基因功能的研究,為闡明真菌作用線蟲(chóng)的分子機(jī)制奠定了前期基礎(chǔ)。少孢節(jié)叢孢菌對(duì)線蟲(chóng)的作用包括吸引、識(shí)

2、別和黏附、侵染、消解等過(guò)程,其中黏附是最關(guān)鍵的一步,是捕食線蟲(chóng)性真菌捕食線蟲(chóng)的基礎(chǔ)。因此,對(duì)少孢節(jié)叢孢菌黏附線蟲(chóng)的研究不但可以揭示真菌與線蟲(chóng)相互作用的分子機(jī)制,而且對(duì)新型線蟲(chóng)生物防控制劑的研發(fā)具有重要的意義。
　　本研究對(duì)新疆阿勒泰地區(qū)的食線蟲(chóng)性真菌進(jìn)行了分離與鑒定,并選取其中少孢節(jié)叢孢菌A1株作為研究對(duì)象,克隆了該菌的一種黏附蛋白(命名為ADP1)基因,并將其與綠色熒光蛋白(GFP)基因融合后在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。表達(dá)的融合蛋

3、白純化后,通過(guò)與線蟲(chóng)的相互作用驗(yàn)證了其黏附功能,為進(jìn)一步揭示真菌黏附線蟲(chóng)的分子機(jī)制及高捕食活性真菌的選育奠定了良好的前期基礎(chǔ)。主要研究方法和結(jié)果如下:
　　1.捕食線蟲(chóng)性真菌的分離鑒定及氨基酸對(duì)其捕食器誘導(dǎo)效應(yīng)研究
　　為了解新疆阿勒泰地區(qū)的捕食線蟲(chóng)性真菌分布情況,采用玉米粉瓊脂培養(yǎng)基(CMA)分離培養(yǎng)阿勒泰地區(qū)土壤中的捕食線蟲(chóng)性真菌,通過(guò)對(duì)純化后菌株的形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)分析,鑒定出5株少孢節(jié)叢孢菌和1株圓錐節(jié)叢孢菌。采

4、用濃度分別為0.5、0.05、0.005g/L的L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸和L-纈氨酸對(duì)已分離的圓錐節(jié)叢孢菌AS3株進(jìn)行捕食器的誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)各組氨基酸對(duì)捕食器的產(chǎn)生均有誘導(dǎo)效應(yīng),且以0.05g/L的L-苯丙氨酸誘導(dǎo)產(chǎn)生的捕食器總數(shù)最多。
　　2.少孢節(jié)叢孢菌黏附分子ADP1基因的克隆、序列分析及其表達(dá)研究
　　通過(guò)PCR方法擴(kuò)增了少孢節(jié)叢孢菌(新疆分離株A1)黏附蛋白ADP1基因,經(jīng)測(cè)序后對(duì)其基本理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了

5、預(yù)測(cè)。通過(guò)酶切的方法將其與GFP基因進(jìn)行融合,構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體pET28a-GFP-ADP1和pET28a-GFP蛋白,分別在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)目的融合蛋白和對(duì)照GFP蛋白分子量大小分別約50 KDa和35 KDa,與預(yù)期大小相符。紫外分光光度法測(cè)定GFP蛋白和GFP-ADP1蛋白的表達(dá)量分別為15.3 mg/mL和12.6mg/mL。
　　3.重組融合蛋白GFP-ADP1的純化及其

6、與線蟲(chóng)作用初步研究
　　將表達(dá)了的融合蛋白GFP-ADP1和對(duì)照蛋白GFP進(jìn)行純化,配成相同的物質(zhì)量濃度于25℃條件下分別與活的的秀麗隱桿線蟲(chóng)J3期幼蟲(chóng)作用1h,用PBS溶液漂洗蟲(chóng)體,分別置于熒光顯微鏡下觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn) GFP-ADP1蛋白組的線蟲(chóng)表面仍能觀測(cè)到綠色熒光,而GFP組在漂洗后檢測(cè)不到綠色熒光,提示GFP-ADP1蛋白對(duì)線蟲(chóng)具有黏附作用。在4、16、25和37℃的溫度下,GFP-ADP1對(duì)線蟲(chóng)發(fā)生作用1h后,經(jīng)漂洗在熒