腦缺血預(yù)處理對(duì)PPARγ信號(hào)通路及GLT-1表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　 過氧化物酶增殖物激活受體(peroxisomeproliferatoractivatedreceptors，PPAR)是一種配體激活型轉(zhuǎn)錄因子，其包括α、β、γ三種亞型。PPARγ作為PPAR家族中的一種亞型，參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝與糖代謝、脂肪細(xì)胞分化、能量平衡、炎癥反應(yīng)等體內(nèi)多種生理和病理生理過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激活后能夠保護(hù)腦組織對(duì)抗缺血性損傷作用。目前，神經(jīng)系統(tǒng)疾病中最常見的疾病之一是缺血性腦血管病。

2、嚴(yán)重的腦缺血常引起細(xì)胞、組織的不可逆性損傷。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，預(yù)先的短暫、輕度、不至于引起神經(jīng)元損傷的適當(dāng)缺血刺激可有效激發(fā)機(jī)體的內(nèi)在保護(hù)機(jī)制，保護(hù)機(jī)體使其能夠耐受隨后的嚴(yán)重?fù)p傷性缺血，從而提高腦組織對(duì)缺血的耐受能力。預(yù)先的適當(dāng)缺血刺激被稱為腦缺血預(yù)處理(cerebralischemicpreconditioning，CIP)。自Kitagawa在1990年首次提出這一現(xiàn)象以來，大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了此現(xiàn)象的存在。本教研室前期實(shí)驗(yàn)觀察到

3、，腦缺血預(yù)處理引起膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(glialglutamatetransporter-1，GLT-1)的大量表達(dá)而誘導(dǎo)腦缺血耐受。腦缺血預(yù)處理是否通過PPARγ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)GLT-1大量表達(dá)目前未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察在大鼠海馬CA1區(qū)PPARγ的表達(dá)及其對(duì)GLT-1蛋白表達(dá)的相關(guān)影響，為將來腦缺血性疾病的防治提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 采用四血管閉塞法(Four-vesselocclusion

4、，4VO)制造大鼠全腦缺血模型，選用健康雄性Wister大鼠(280-320g)240只。隨機(jī)分為以下兩部分:
　　 1、在腦缺血耐受誘導(dǎo)過程中，大鼠海馬CA1區(qū)PPARγ蛋白的表達(dá)
　　 首先永久凝閉大鼠椎動(dòng)脈，恢復(fù)2天后，進(jìn)行全腦缺血，然后恢復(fù)血流再灌注，具體分組如下(n=45):①假手術(shù)(sham)組:只暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不阻斷血流;②CIP組:夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3min;③損傷性缺血(ischemicinsult，

5、Ⅱ)組:夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8min;④CIP+Ⅱ組:夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3min作為腦缺血預(yù)處理，再灌2天后，再次夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8min作為損傷性缺血。每個(gè)組均分為9個(gè)時(shí)間點(diǎn)，即假手術(shù)處理后或末次缺血后0min、15min、30min、3h、6h、1d、2d、4d和7d（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=5）。
　　 在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)，斷頭取海馬CA1區(qū)腦組織，應(yīng)用Westernblot方法觀察PPARγ蛋白的表達(dá)。
　　 2、PPARγ的特異性

6、抑制劑GW9662對(duì)GLT-1蛋白表達(dá)的影響
　　 具體分組如下:①3％DMSO+CIP+Ⅱ組(n=30);②GW9662+CIP+II(n=30)。CIP前30分鐘在側(cè)腦室分別注射3％DMSO或GW9662(劑量為5nmol)，然后同CIP+Ⅱ組。于末次缺血后即刻(0min)、3h、6h、1d、4d、7d時(shí)取海馬CA1區(qū)腦組織，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只，應(yīng)用westernblot法觀察GLT-1蛋白的表達(dá)，探討抑制PPARγ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

7、對(duì)GLT-1蛋白表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、在腦缺血耐受誘導(dǎo)過程中，大鼠海馬CA1區(qū)PPARγ蛋白的表達(dá)
　　 Westernblot分析顯示，sham組大鼠海馬CA1區(qū)PPARγ蛋白的表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均無顯著差異(P＞0.05）。
　　 在腦缺血預(yù)處理組，與即刻時(shí)間點(diǎn)相比，經(jīng)腦缺血預(yù)處理后，PPARγ蛋白的表達(dá)在30min時(shí)間點(diǎn)明顯升高，于3h時(shí)間點(diǎn)表達(dá)達(dá)到高峰，其積分光密度高達(dá)即刻時(shí)間點(diǎn)的2.

8、5倍;從6h時(shí)間點(diǎn)開始，恢復(fù)至即刻時(shí)間點(diǎn)水平。
　　 損傷性缺血組，經(jīng)8min全腦缺血打擊后，PPARγ蛋白的表達(dá)與即刻時(shí)間點(diǎn)相比于15min時(shí)間點(diǎn)明顯升高（P＜0.05）;在30min、3h、6h時(shí)間點(diǎn)升高更為顯著(P＜0.01)，其積分光密度高達(dá)即刻時(shí)間點(diǎn)的10倍;在1d、2d、4d時(shí)間點(diǎn)雖有所回落，但仍處于較高水平(P＜0.05);7d時(shí)間點(diǎn)進(jìn)一步下降，但仍明顯高于即刻時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05）。上述結(jié)果表明，嚴(yán)重缺血打擊組8

9、min全腦缺血后PPARγ蛋白的表達(dá)明顯升高。
　　 在腦缺血預(yù)處理+損傷性缺血組（CIP+Ⅱ組）中，PPARγ蛋白的表達(dá)與即刻時(shí)間相比，在6h時(shí)間點(diǎn)明顯升高(P＜0.05)，IOD值為即刻時(shí)間點(diǎn)的1.35倍;自2d時(shí)間點(diǎn)開始直至7d時(shí)間點(diǎn)PPARγ蛋白的表達(dá)均明顯下降（P＜0.05）;其余時(shí)間點(diǎn)均無顯著差異(P＞0.05）。
　　 2、PPARγ的特異性抑制劑GW9662對(duì)GLT-1蛋白表達(dá)的影響
　　 DMS

10、O+CIP+Ⅱ組，在即刻、3h、6h、1d、4d、7d總共六個(gè)時(shí)間點(diǎn)的GLT-1的蛋白表達(dá)均較高。與DMSO+CIP+Ⅱ組的各個(gè)相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)相比較，5nmolGW9662+CIP+Ⅱ組GLT-1蛋白的表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著降低(P＜0.05）。
　　 小結(jié):
　　 1、CIP引起PPARγ蛋白的適度上調(diào);損傷性缺血引起PPARγ蛋白的持久而強(qiáng)烈上調(diào);提前2天進(jìn)行的3min腦缺血預(yù)處理，明顯抑制了8min損傷性缺血引起P