廣東漢族人群2型糖尿病和冠心病患者eNOS基因G894T多態(tài)性與血管內(nèi)皮舒張功能的研究.pdf

1、2型糖尿病和冠心病是中老年人的常見病和多發(fā)病。冠心病的發(fā)生除了與遺傳因素有關(guān)外，還與年齡、性別、高血脂、高血壓、高血糖、吸煙、高同型半胱氨酸血癥、胰島素抵抗、肥胖等多種危險(xiǎn)因素有關(guān)。糖尿病患者由于常同時(shí)存在多種危險(xiǎn)因素，因而其冠心病發(fā)病率較血糖正常者高2倍左右。 冠心病中各種危險(xiǎn)因素導(dǎo)致了動(dòng)脈內(nèi)膜損傷，而動(dòng)脈粥樣斑塊的形成是對(duì)內(nèi)膜損傷作出反應(yīng)的結(jié)果，因此，冠狀動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和進(jìn)展與血管內(nèi)皮的損傷、血管內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān)

2、。超聲檢測FMD、GTNMD是目前首選的無創(chuàng)性評(píng)價(jià)血管內(nèi)皮功能方法，雖然存在一定的個(gè)體、人群差異，國內(nèi)外大量經(jīng)超聲檢測肱動(dòng)脈FMD、GTNMD的研究認(rèn)為2型糖尿病、冠心病患者存在明顯的血管內(nèi)皮舒張功能障礙，且部分研究提示可能有遺傳因素的作用。 一氧化氮(NO)是已知最重要的內(nèi)源性血管舒張因子之一，是維持正常血管功能的重要分子，NO產(chǎn)生的減少會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化。在心臟和血管中，NO主要由內(nèi)皮型一氧化氮合成

3、酶(eNOS)催化合成。eNOS表達(dá)的多少和活性的強(qiáng)弱是NO生成多少的決定因素。NO產(chǎn)生減少的主要機(jī)制有：①eNOS基因發(fā)生突變，如eNOS基因G894T突變導(dǎo)致產(chǎn)生的eNOS減少或者活性降低；②各種原因?qū)е碌膃NOS活性下降而其競爭性抑制劑非對(duì)稱性二甲基精氨酸(ADMA)活性增強(qiáng)等。 其中，在美國、英國、法國等人群中的研究顯示eNOS基因G894T多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(包括心絞痛、心肌梗死等亞型)密切相關(guān)，T等位基

4、因攜帶者發(fā)生冠心病的危險(xiǎn)明顯增加。然而，在印度、土耳其、希臘人群中eNOS基因G894T多態(tài)性與冠心病的關(guān)系并不密切。此外，亞洲人群中eNOS基因Glu298AspGT/TT基因型和T等位基因頻率明顯低于歐美人群，體現(xiàn)出明顯的人群差異。 本課題擬研究廣東漢族人群2型糖尿病和冠心病患者eNOS基因G894T多態(tài)性特征，利用超聲檢測研究對(duì)象的FMD、GTNMD以評(píng)價(jià)其血管內(nèi)皮舒張功能狀況，進(jìn)一步探討eNOS基因G894T多態(tài)性與血管

5、內(nèi)皮舒張功能的相關(guān)性。 第一部分廣東漢族人群2型糖尿病和冠心病患者 eNOS基因G894T多態(tài)性的研究 一、研究目的 研究廣東漢族人群2型糖尿病和冠心病患者eNOS基因G894T多態(tài)性特征，探討eNOS基因G894T多態(tài)性與冠心病發(fā)病的關(guān)系。 二、研究對(duì)象與方法 (一)研究對(duì)象 廣東籍漢族人群糖尿病和冠心病患者313例，其中男164例，女149例，年齡28～86歲，平均(60.18±11.

6、93)歲。根據(jù)有無T2DM或CHD分為三個(gè)組： ①2型糖尿病并冠心病組(T2DM+CHD)：同時(shí)符合2型糖尿病與冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)，共53例，其中男26例，女27例，年齡40～81歲，平均(66.32±10.44)歲。 ②單純2型糖尿病組(T2DM)：符合糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，但排除冠心病，共181例，其中男91例，女90例，年齡32～85歲，平均(55.21±10.52)歲。 ③冠心病組(CHD)：符合冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)，但

7、排除糖尿病，共79例，其中男47例，女32例，年齡28～86歲，平均(67.46±10.23)歲。 (二)研究方法 1、DNA提取：抽取患者外周靜脈全血約2ml，EDTA—Na2抗凝，按“基因組DNA提取試劑盒”說明書的方法提取基因組DNA。 2、目的基因PCR—RFLP分析： ①目的基因PCR擴(kuò)增：采用25μl反應(yīng)體系進(jìn)行30個(gè)反應(yīng)循環(huán)，引物為：Primer1：5’—AAG GCA GGA GAC AG

8、T GGA TGGA—3’，Primer2：5’—CCC AGTCAA TCC CTT TGG TGC TCA—3'。 ②用限制性內(nèi)切酶BanⅡ?qū)CR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。 ③酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察酶切產(chǎn)物的片段大小及數(shù)目，判斷樣本的基因型。 ④酶切產(chǎn)物基因測序：判斷目的基因有無突變，并與PCR—RFLP結(jié)果進(jìn)行對(duì)照分析。 三、研究結(jié)果 1、目的基因PCR—RFLP分析(結(jié)果

9、由基因測序證實(shí))： ①基因型為GG時(shí)顯示163bp和85bp兩個(gè)片段； ②基因型為GT時(shí)顯示248bp、163bp和85bp三個(gè)片段； ③基因型為TT時(shí)顯示248bp一個(gè)片段。 2、基因多態(tài)性分析結(jié)果： ①eNOS基因G894T多態(tài)性GG、GT、TT和G、T頻率： 2型糖尿病并冠心病組71.7％、24.5％、3.8％、84.0％、16.0％：單純2型糖尿病組86.2％、13.3％、0.6％

10、、92.8％、7.2％；冠心病組73.4％、26.6％、0、86.7％、13.3％。 ②G894T基因型頻率、G/T等位基因頻率和G894T突變率組間比較：2型糖尿病并冠心病組和冠心病組明顯高于單純2型糖尿病組(P<0.05)，而2型糖尿病并冠心病組與冠心病組之間無顯著性差異(P>0.05) ③G/T等位基因攜帶者冠心病危險(xiǎn)分析： T等位基因攜帶者患冠心病與G等位基因攜帶者患冠心病的優(yōu)勢比為：OR=2.340(

11、95％CI：1.323-4.138)，P<0.01；將2型糖尿病并冠心病組與單純2型糖尿病組合并分析，2型糖尿病患者中T等位基因攜帶者患冠心病與G等位基因攜帶者患冠心病的優(yōu)勢比為：OR=2.463(95％CI：1.185～5.120)，P<0.05。 四、研究結(jié)論 eNOS基因G894T多態(tài)性中GT/TT基因型和T等位基因是本組病例中冠心病的危險(xiǎn)因素，eNOS基因G894T突變能夠增加冠心病的發(fā)病危險(xiǎn)。在2型糖尿病患者

12、中，eNOS基因G894T突變同樣能夠增加2型糖尿病患者的冠心病發(fā)病危險(xiǎn)。 第二部分廣東漢族人群2型糖尿病和冠心病患者血管內(nèi)皮舒張功能的超聲研究 一、研究目的 評(píng)價(jià)廣東漢族人群2型糖尿病和冠心病患者eNOS基因G894T多態(tài)性GT型與GG型之間的FMD和GTNMD，探討eNOS基因G894T多態(tài)性與血管內(nèi)皮功能障礙的關(guān)系。 二、研究對(duì)象與方法 (一)研究對(duì)象 對(duì)前述313例患者中的175例

13、進(jìn)行了肱動(dòng)脈血管內(nèi)皮功能超聲檢測，其中男95例，女80例，年齡32～79歲，平均(55.25±10.91)歲。其余128例(包括3例TT型患者)因各種原因未能進(jìn)行血管內(nèi)皮功能檢測。根據(jù)eNOS基因G894T基因型分為兩組，兩組患者一般資料之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 ①GG組：共141例，男75例，女66例，年齡32～79歲，平均(55.4±10.9)歲 ②GT組：共34例，男20例，女14例，年齡28～78歲，平均(54.

14、6±11.0)歲 (二)研究方法——高頻超聲無創(chuàng)性檢測FMD和GTNMD 1、儀器和試劑：①GE Logic—9型超聲診斷儀，7-14MHz線陣探頭；②血壓計(jì)；③硝酸甘油片(0.5mg/片)。 2、肱動(dòng)脈內(nèi)皮舒張功能檢測方法：參照Celermager等報(bào)告的方法。 (1)測量內(nèi)容： ①基礎(chǔ)狀態(tài)下肱動(dòng)脈內(nèi)徑(D0)：患者于室溫22～25℃下平臥至少10min后測量，記為D0； ②反應(yīng)性充血后

15、肱動(dòng)脈內(nèi)徑(D1)：將血壓帶置于肘上5cm以上的右上臂，充氣加壓到280mmHg左右，持續(xù)5min，迅速減壓至0mmHg，減壓后約60s～90s時(shí)測量肱動(dòng)脈內(nèi)徑，記為D1； ③恢復(fù)后內(nèi)徑(D2)：休息約15min～30min后測量恢復(fù)后內(nèi)徑，記為D2； ④舌下含服硝酸甘油后內(nèi)徑(D3)：舌下含服硝酸甘油0.5mg，以硝酸甘油片完全融化為準(zhǔn)，5min后再重復(fù)上述測量，記為D3。 (2)計(jì)算方法： ①FMD=

16、(D1-D0)/D0×100％ ②GTNMD=(D3-D2)/D2×100％ 三、研究結(jié)果 1、GG型與GT型患者的FMD分別為：(18.15±7.33)％和(14.94±6.19)％，GTNMD分別為：(22.93±9.23)％和(19.42±7.13)％；GG組與GT組FMD、GTNMD之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，GT組FMD和GTNMD較GG組差。 2、單因素分析及多重回歸分析均顯示F

17、MD、GTNMD與eNOS基因G894T分型顯著相關(guān)。 四、研究結(jié)論 FMD和GTNMD與eNOS基因G894T多態(tài)性相關(guān)，GT型患者的FMD和GTNMD均較GG型患者受損明顯。 全文結(jié)論： ①在本研究的廣東漢族人群2型糖尿病和冠心病患者中，eNOS基因G894T多態(tài)性中GG型占80.5％、GT型占18.5％、TT型占1.0％，突變率(GT型+TT型)為19.5％；G等位基因頻率為89.8％，T等位基因