禽病原性大腸桿菌O2分離株外膜蛋白OmpT純化與結(jié)晶條件的初步研究.pdf

1、禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(avian pathogenic Escherichia coli，APEC)引起禽類(lèi)的一種復(fù)雜的多系統(tǒng)綜合征的總稱(chēng)。禽致病性大腸桿菌病目前已成為雞群中非常嚴(yán)重的一種細(xì)菌病，大腸桿菌敗血癥、心包炎、肝周炎、氣囊炎等是大腸桿菌病在臨床上的主要表現(xiàn)特征，并常常伴隨不同程度的死亡率，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)越來(lái)越多的證據(jù)表明APEC具有人獸共患病的潛能。
　　外膜蛋白T(Outer membra

2、ne protein T，OmpT)定位于大腸桿菌外膜，是具有高度底物特異性的蛋白水解酶，屬于革蘭氏陰性菌外膜蛋白家族。APEC中的OmpT蛋白由位于染色質(zhì)的ompT基因(c-ompT)和位于質(zhì)粒中的ompT基因(p-ompT)分別編碼，但在行使功能方面存在一定差異。通過(guò)基因的序列比對(duì)可以發(fā)現(xiàn)位于質(zhì)粒pAPEC-O2-ColV中的ompT基因(p-ompT)與位于染色質(zhì)的ompT基因(c-ompT)同源性為79％。本研究旨在探討p-Om

3、pT的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系，了解c-OmpT和p-OmpT的結(jié)構(gòu)差異，從而闡明c-OmpT和p-OmpT之間功能上的差異問(wèn)題，為了解APEC的致病機(jī)理和探求特異性防治措施奠定基礎(chǔ)。
　　通過(guò)同時(shí)構(gòu)建含有c-ompT或p-o mpT基因的重組表達(dá)載體，并分別轉(zhuǎn)化到工程宿主菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。魚(yú)精蛋白抑制試驗(yàn)顯示，含有p-ompT基因的細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制，而含有c-ompT的細(xì)菌則生長(zhǎng)不受影響。為了進(jìn)一步研究p-OmpT

4、的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)以禽致病性大腸桿菌E058的基因組為DNA模板，PCR擴(kuò)增出p-ompT基因片段，并且連接在表達(dá)載體上，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒。然后在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行了異源表達(dá)。由于誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中形成無(wú)蛋白活性的包涵體，需要經(jīng)過(guò)變性和復(fù)性，以恢復(fù)蛋白生物活性，然后利用離子交換和凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行蛋白純化，得到高純度且聚合狀態(tài)單一的p-OmpT蛋白樣品。將純化出來(lái)的蛋白利用氣相擴(kuò)散坐滴法進(jìn)行蛋白結(jié)晶條件篩選，并對(duì)結(jié)