大豆GmFAD3C基因在花生中的表達(dá)及分析.pdf

1、必需脂肪酸(essential fatty acids)在人和高等動(dòng)物體內(nèi)不能合成,必須從食物中攝取.其中α-亞麻酸(α-linolenic acid,ALA,C18:3<'△9,12,15>)和亞油酸(linoleic acid,LA,C18:2<'△9,12>)是研究比較多的必需脂肪酸,α-亞麻酸屬于n-3多不飽和脂肪酸(PUFAs),它在體內(nèi)經(jīng)過(guò)一系列的脫氫和加長(zhǎng)反應(yīng)可以生成EPA、DHA等其它n-3 PUFAs.亞油酸屬于n-6

2、多不飽和脂肪酸(PUFAs),經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)可以生成γ-亞麻酸(γ-linolenic acid,GLA)、花生四烯酸(arachidonic acid,AA)等其他n-6PUFAs.n-6和n-3 PUFAs的功能在很多方面是相反的,它們相互協(xié)調(diào)制約,共同調(diào)節(jié)生物體的生命活動(dòng).所以n-6/n-3 PUFAs的膳食平衡非常重要,但是人的膳食中該比值一般嚴(yán)重偏高,n-6 PUFAs相對(duì)過(guò)量,n-3 PUFAs嚴(yán)重缺乏.這導(dǎo)致高血栓,動(dòng)脈粥

3、樣化,癌癥的發(fā)病率增加,炎癥增強(qiáng)等癥狀.所以對(duì)油脂的研究方向應(yīng)該是降低n-6/n-3PUFAs的比值,使其更加有利于人們的健康.對(duì)PUFAs的研究在分子生物學(xué)上體現(xiàn)在對(duì)PUFAs合成酶的研究.本試驗(yàn)所應(yīng)用的酶即是催化由LA向ALA轉(zhuǎn)化的酶. 花生是世界第四大油料作物,作為我國(guó)的主要油料作物,其總產(chǎn)居各油料作物之首.我國(guó)花生50﹪以上用于榨油,花生油中LA的比例為15﹪-43﹪,卻不含任何n-3PUFAs.因此通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法使得花

4、生表達(dá)相關(guān)基因,促使部分LA轉(zhuǎn)變成ALA,是改變花生種質(zhì)的一種有效方法.大豆(Glycine max)種子油中ALA含量較高.Bilyeu KD等2003年克隆了大豆GmFAD3基因.在未成熟種子中,GmFAD3A和GmFAD3C的表達(dá)量分別是持家基因的60﹪和0.2﹪,GmFAD3B未檢測(cè)到表達(dá).并且他們發(fā)現(xiàn)GmFAD3A是大豆種子油中ALA水平主要貢獻(xiàn)者,其貢獻(xiàn)量是GmFAD3C的三倍.后來(lái)他們又發(fā)現(xiàn)GmFAD3A完全突變后,花生油

5、中α-亞麻酸減少量大約為46g Kg<'-1>油<'[-]>;而GmFAD3C完全突變后,花生油中α-亞麻酸減少量大約為15g Kg<'-1>油.前者是后者的三倍.也就是說(shuō),GmFAD3A擁有300倍于GmFAD3C的表達(dá)量,卻只有3倍于GmFAD3C的α-亞麻酸貢獻(xiàn)量.由此可以推測(cè),相同量的GmFAD3C與GmFAD3A的α-亞麻酸貢獻(xiàn)量之比為100/1,因此GmFAD3C比GmFAD3A的活性要強(qiáng)的多,GmFAD3C分子比GmFAD

6、3A分子更穩(wěn)定.在大豆種子中,活性很高的GmFAD3C表達(dá)量很低,而活性極低的GmFAD3A表達(dá)量卻極高.植物主要靠過(guò)量表達(dá)一個(gè)活性低的ω-3脂肪酸脫氫酶來(lái)貢獻(xiàn)α-亞麻酸,而不是稍微多表達(dá)一點(diǎn) GmFAD3C.這其中的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究.因此本試驗(yàn)采用活性較高的GmFAD3C基因,在其表達(dá)后能夠更容易分析花生中脂肪酸含量的變化. 本實(shí)驗(yàn)用RT-PCR.方法從大豆未成熟種子中擴(kuò)增出GmFAD3C的cDNA,連入pUCm-T,得pU

7、GFAD3C.最后連接到植物表達(dá)載體pROKII中,建成了pROK-Ⅱ.FAD3C重組載體,轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化花生豐花3號(hào),用胚軸和子葉作為外植體,經(jīng)過(guò)比較后發(fā)現(xiàn)胚軸作為外植體較為優(yōu)異,由此建立了豐花3號(hào)的遺傳轉(zhuǎn)化體系.經(jīng)過(guò)卡那霉素的篩選得到抗性苗,提取抗性苗的基因組DNA,用PCR以及PCR southern鑒定出了轉(zhuǎn)基因植株.一方面通過(guò)氣相色譜分析花生脂肪酸成份的變化可以進(jìn)一步證明GmFAD3C的功能,另