應(yīng)用膜片鉗技術(shù)對人食管下括約肌L型鈣離子通道的研究.pdf

1、目的:1979年Liebermann-Meffer等學者通過對32例尸體食管胃連接部(esophagogastric junction,EGJ)標本的解剖學研究,從而詳細闡述了食管胃連接部平滑肌束的大體排列方式,進而提出了人類食管下括約肌(lower esophageal sphincter,LES)是由鉤狀纖維(clasp fiber)和套索纖維(sling fiber)共同構(gòu)成的這一理論。Liebermann-Meffert等學者認

2、為這兩種纖維共同維持了LES的靜息高壓狀態(tài),從而形成了LES高壓帶(high-pressurezone,HPZ,15～30mmHg)。這一發(fā)現(xiàn)為進一步對LES的病理、藥理以及生理學特性奠定了解剖學基礎(chǔ)。隨后學者們對不同動物的LES的功能調(diào)節(jié)機制和生理學特點進行了更為深入的研究。
　　 目前已被公認,平滑肌細胞胞漿游離Ca2+在平滑肌收縮過程中起著極為重要的“第二信使”作用。細胞內(nèi)游離鈣濃度的變化是Ca2+跨細胞膜轉(zhuǎn)運和細胞內(nèi)貯鈣

3、池(肌漿網(wǎng)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)攝取、釋放鈣等過程中動態(tài)平衡改變的結(jié)果。平滑肌細胞的收縮活動依賴于胞漿中Ca2+的濃度,低濃度的Ca2+引起平滑肌的舒張,高濃度的Ca2+引起平滑肌的收縮。引起平滑肌收縮的Ca2+主要來源于細胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)和細胞外液的Ca2+。一般認為,細胞外鈣跨膜進入細胞是細胞內(nèi)鈣釋放的觸發(fā)因素,細胞內(nèi)Ca2+增加主要取決于細胞內(nèi)鈣離子的釋放。細胞外液的Ca2+可通過細胞膜上的電壓依賴性鈣離子通道(voltage depen

4、dent calcium channel,VDCC)進入細胞。電壓依賴性鈣通道可以分為L型、T型、N型等亞型。在平滑肌細胞膜上主要有L型和T型兩種電壓門控式鈣通道。與L型鈣通道有所不同的是,T型鈣離子通道的密度與細胞生長有關(guān),正常情況下機體內(nèi)平滑肌細胞膜上的T型鈣離子通道只有很少量的表達。L型鈣通道具有細胞外鈣離子濃度依賴性,并且L型鈣通道的電流隨細胞外鈣濃度的增加而增加。鈣離子通道普遍存在于所有可興奮以及一些非可興奮細胞甚至原核生物細

5、胞膜上。與骨骼肌、心肌舒縮的機制相類似,L型鈣離子通道在平滑肌細胞的舒縮機制中起著關(guān)鍵作用。當平滑肌細胞膜去極化時,通過L型鈣離子通道進入細胞內(nèi)的Ca2+是平滑肌細胞收縮的主要觸發(fā)因素。
　　 1976年Neher和Sakmann建立了膜片鉗技術(shù)(patch clamp recordingtechnique),膜片鉗技術(shù)是一種以記錄通過離子通道的離子流來反映細胞膜上單一的或多數(shù)的離子通道分子活動的技術(shù)。自從上世紀80年代開始應(yīng)用

6、于細胞膜離子通道研究以來,不僅為從分子水平了解細胞單離子通道的開放或關(guān)閉的動力學、膜選擇通透和興奮性提供了直接手段,而且也為我們從離子通道水平闡明某些疾病的發(fā)生機制以及藥物作用機制提供了直接檢測手段。
　　 本研究應(yīng)用細胞膜片鉗技術(shù)對人類LES平滑肌細胞膜上鈣離子通道的類型以及常見的影響因素進行分析,并深入探討套索纖維和鉤狀纖維可能具有的不同生物學特征及其內(nèi)在調(diào)節(jié)機制?？梢灶A(yù)見,對于LES的電生理研究將有助于對賁門失弛癥、食管下

7、括約肌高壓癥等食管運動功能障礙性疾病,以及胃食管返流病(gastroesophageal reflux disease GERD)等食管良性疾病病因的理解以及治療方法的改進。
　　 方法:選取自2008年11月到2009年12月在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院因食管中段癌行食管大部切除術(shù)的患者25例。其中,男性17例,女性8例,平均年齡54.2歲。從手術(shù)室采取新鮮手術(shù)標本,銳性剝離賁門部及食管下段的粘膜層及粘膜下層后,剪取套索纖維及鉤狀纖

8、維肌條,并把肌條剪成體積為2mm3小塊,用含膠原酶Ⅱ和木瓜酶的細胞分離液分離出單個平滑肌細胞。確認細胞存活率在95％以上。然后保存于37℃Hepes緩沖液中備用。
　　 細胞存活率測定:用滴管吸取5滴細胞懸浮液,加入1滴0.2％的臺盼藍溶液,并于混勻后3分鐘以內(nèi)計數(shù),死亡的細胞將會被染成紅色,而活細胞仍能保持無色狀態(tài)。細胞存活率計算公式:存活率(％)=活細胞總數(shù)/(活細胞數(shù)+死細胞數(shù))×100％。
　　 將細胞灌流槽固定

9、在倒置顯微鏡的工作臺上,吸取數(shù)滴平滑肌細胞懸液滴于灌流槽中,靜置5分鐘,待細胞貼壁后,用與鈣電流相應(yīng)的灌流液灌流,沖洗掉死亡懸浮的細胞,選取附壁的、表面光滑整潔的、邊緣整齊的、靜止不動的、立體感強的細胞作為研究對象。電極由硬質(zhì)玻璃毛坯經(jīng)水平拉制儀(Sutter P-97,USA)四步拉制而成,充以鈣離子電極內(nèi)液后阻抗為2～3MΩ。用三維液壓微操縱器移動電極并貼近所選取的細胞進行封接。封接成功后,通過抽吸所造成的負壓吸引使電極尖端內(nèi)的細胞

10、膜破裂,電極內(nèi)液和細胞內(nèi)液相通,從而在電極與細胞膜之間形成1GΩ以上的高阻抗封接,調(diào)節(jié)快補償以抵消電極夾持器與電極管壁的電容,再對電極施加負壓吸破細胞膜,見電容放電突然增大并伴有噪聲增大形成全細胞記錄模式,調(diào)節(jié)慢電容補償和串聯(lián)補償以減少瞬時充放電電流和鉗位誤差。
　　 脈沖信號由pulse+pulsefit軟件(HEKA,version8.53,法耳次,德國)控制,通道信號用EPC-9膜片鉗信號放大器(HEKA,法耳次,德國)放

11、大,通過Ag-AgCl電極絲和填充電極內(nèi)液的微電極導入細胞,產(chǎn)生的電流信號通過EPC-9轉(zhuǎn)換,被pulse+pulsefit軟件所收集、分析,收集到的數(shù)據(jù)采用Origin7.5擬合。所有實驗均在室溫(25℃)下進行。所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示,兩組均數(shù)的比較采用t檢驗進行統(tǒng)計學分析,通過軟件SPSS14.0(SPSS公司,芝加哥,美國)完成。以P＜0.05為差異認為在統(tǒng)計學上有顯著性意義。
　　 結(jié)果:
　　 1食管下

12、段括約肌細胞的形狀
　　 在倒置顯微鏡下觀察,新鮮分離的食管下括約肌套索纖維和鉤狀纖維平滑肌細胞均呈梭形,大小不一,長短各異。在Hepes緩沖液中置于高倍鏡下觀察,部分細胞舒張,部分細胞處于不同程度的收縮狀態(tài)。套索纖維和鉤狀纖維平滑肌細胞均只有一個中心性核仁。套索纖維細胞平均長度為99.8±25.4μm(53～15lμm,n=200);鉤狀纖維平滑肌細胞平均長度為100.5±26.9μm(45～143μm,n=200)。兩者相比

13、較無統(tǒng)計學意義(t=0.244,P=0.676)。
　　 2Ⅰ-Ⅴ曲線
　　 分別將選定細胞鉗制在-90mV和-60mV,并以10mV的階躍從-80mV到+30mV,時程200ms刺激細胞去極化。此時可記錄到—內(nèi)向電流,在約-50mV處反轉(zhuǎn)。兩次不同鉗制電壓的IV曲線均呈U型,不過峰值不同,在鉗制電壓為-90mV時的內(nèi)向電流-7.11±1.01pA/Pf(n=6)。鉗制電壓為-60mV時為-5.75±1.49pA/Pf(

14、n=6)顯著低于鉗制電壓為-90mV時的內(nèi)向電流-7.11±1.01pA/Pf(n=6)。兩者相比較有統(tǒng)計學意義(t=2.142,P=0.041)。而且套索纖維平滑肌細胞與鉤狀纖維平滑肌細胞所記錄到的鈣電流未發(fā)現(xiàn)明顯不同。
　　 3乙酰膽堿對鈣離子內(nèi)向電流的影響
　　 乙酰膽堿可以明顯激活L型鈣離子通道,引起鈣電流峰值增大。加入1μmmol/L的乙酰膽堿后鉗制電壓為-60mV和-90mV的峰值分別為-9.21±0.94p

15、A/Pf(n=6)和-9.89±1.32pA/Pf(n=6)。正常電流峰值在鉗制電壓為-60mV和-90mV時分別為-5.75±1.49pA/Pf(n=6)和-7.11±1.01pA/Pf(n=6)。兩者相比較分別為(t=8.142,P=0.000)及(t=8.851,P=0.000)。在乙酰膽堿濃度為5μmmol/L和10μmmol/L時也具有相同趨勢。
　　 結(jié)論:
　　 1鉤狀纖維細胞與套索纖維細胞的大小、形態(tài)基本