小鼠胚胎E10～E12造血擴(kuò)增部位的探尋及其分子作用機(jī)制的研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：探討AGM時(shí)期（E10～E12）小鼠造血部位的解剖結(jié)構(gòu)
　　 目的：探討AGM時(shí)期（E10～E12）小鼠造血部位的解剖結(jié)構(gòu)。
　　 方法：將雌、雄小鼠以3：1合籠喂養(yǎng)，觀察小鼠陰道栓獲得準(zhǔn)確孕期的小鼠胚胎，收集E10，E10.5，E11，E11.5和E12小鼠胚胎，去掉胎膜和胎盤，用4%甲醛固定3h后，進(jìn)行乙醇脫水，石蠟包埋，通過胚胎正中矢狀面組織切片，進(jìn)行HE染色，在顯微鏡

2、下連續(xù)觀察造血部位的組織結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果：胚胎正中矢狀面切片，自E10到E12，在腹部背側(cè)并沒有見到典型的性腺，即中腎和主動(dòng)脈構(gòu)成的空腔管狀結(jié)構(gòu)，卻發(fā)現(xiàn)在E10時(shí)心臟已經(jīng)發(fā)育，表現(xiàn)為圓球形，內(nèi)部由心肌細(xì)胞及表面的內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成網(wǎng)狀的空間結(jié)構(gòu)，可以看到E10小鼠胚胎已經(jīng)建立循環(huán)，血管管腔和心臟內(nèi)部可見少量胞體較大、胞漿豐富的造血干細(xì)胞。E11的心臟組織切片形態(tài)較E10.5并無明顯變化，但此時(shí)期心腔內(nèi)的造血細(xì)胞數(shù)量明顯增多，容易見到

3、造血細(xì)胞與心臟內(nèi)皮細(xì)胞接觸。隨著胚胎的發(fā)育，心臟的形態(tài)很快變化，內(nèi)部網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸減少，在E12已具備成體心臟的特點(diǎn)，成為空腔性結(jié)構(gòu)。小鼠E10胚胎中胎肝已經(jīng)發(fā)育，起初為實(shí)質(zhì)的結(jié)構(gòu)，由胎肝細(xì)胞緊密聯(lián)系而構(gòu)成，內(nèi)部管腔少，隨著胚胎的發(fā)育，胎肝內(nèi)部血管增多。
　　 結(jié)論：通過E10～E12胚胎正中矢狀面連續(xù)切片和HE染色，并未發(fā)現(xiàn)典型的AGM區(qū)結(jié)構(gòu)，可能與組織切片的局限性有關(guān)；心臟起初內(nèi)部呈復(fù)雜的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且心肌細(xì)胞表面覆蓋有一層

4、內(nèi)皮細(xì)胞，在造血干細(xì)胞發(fā)育過程中構(gòu)成了巨大的表面積。
　　 第二部分：探討E10～E12期間小鼠胚胎造血發(fā)育的分子機(jī)制
　　 目的：研究E10～E12期間小鼠胚胎心臟內(nèi)皮細(xì)胞特性及與造血的發(fā)育相關(guān)的分子機(jī)制。
　　 方法：將E10～E12小鼠胚胎的組織切片做免疫組化，檢測(cè)胚胎心臟是否表達(dá)血管特異性標(biāo)志CD34蛋白；利用已制備好的石蠟切片，通過免疫組化檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)胚胎心臟和胎肝中Notch信號(hào)通路相關(guān)分子，Notc

5、h1和Jagged1蛋白的表達(dá)水平；并且用免疫磁珠分選出c-kit陽性細(xì)胞，通過免疫熒光的方法檢測(cè)其細(xì)胞表面Notch1蛋白的表達(dá)情況。分別取出E10，E10.5，E11，E11.5和E12的胚胎心臟、胎肝和AGM區(qū)組織，經(jīng)機(jī)械碾磨、膠原酶消化和過濾制備單個(gè)細(xì)胞懸液，采用差異貼壁法及貼壁培養(yǎng)獲得基質(zhì)細(xì)胞，觀察各組織貼壁細(xì)胞形態(tài)，檢測(cè)CD31表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：E10～E12的小鼠胚胎心臟的心肌細(xì)胞及其表面的內(nèi)皮細(xì)胞均表達(dá)血管

6、特異性標(biāo)志CD34蛋白，以E11表達(dá)強(qiáng)度最高，同時(shí)可以見到循環(huán)的造血細(xì)胞也大多表達(dá)CD34抗原。對(duì)組織切片進(jìn)行了Notch信號(hào)通路免疫組化的研究，發(fā)現(xiàn)E10心臟心肌細(xì)胞及其表面的內(nèi)皮細(xì)胞形成的中空的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)都表達(dá)Jagged1蛋白和Notch1蛋白，前者表達(dá)水平高于后者，以E10.5時(shí)水平最高，且隨著心臟的發(fā)育和形態(tài)改變，表達(dá)水平逐漸下降，到E12時(shí)幾乎消失。同時(shí)發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞也表達(dá)Jagged1，但是不表達(dá)Notch1蛋白。用c-k

7、it單抗的免疫磁珠分選出c-kit陽性細(xì)胞，通過免疫熒光，顯示這群細(xì)胞表面均勻的表達(dá)Notch1蛋白。原代心臟貼壁細(xì)胞由體積較大、胞漿豐富、呈不規(guī)則形的心肌細(xì)胞和細(xì)長梭形、胞漿較少的內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，容易看到心臟內(nèi)皮細(xì)胞貼附在心肌細(xì)胞表面，呈均一的細(xì)長梭形排列，表達(dá)CD31抗原。胎肝貼壁細(xì)胞形態(tài)相對(duì)均一，均為胞體較大、胞漿豐富的細(xì)胞。同期AGM區(qū)貼壁細(xì)胞在原代細(xì)胞中也可見兩個(gè)細(xì)胞群體，包括胞體較大的貼壁細(xì)胞和細(xì)長梭形的內(nèi)皮細(xì)胞，形態(tài)與心臟貼

8、壁細(xì)胞相似。
　　 結(jié)論：胚胎E10～E12期間心臟的心肌細(xì)胞及其內(nèi)皮細(xì)胞均表達(dá)CD34抗原，具備血管內(nèi)皮細(xì)胞特性，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成巨大的表面積，并且高表達(dá)Jagged1和Notch1蛋白，形成胚胎造血良好的微環(huán)境，可能參與此時(shí)期造血干細(xì)胞的發(fā)育和擴(kuò)增。
　　 第三部分：E10～E12時(shí)期造血相關(guān)部位 Notch信號(hào)通路的變化水平及對(duì)胚胎中期 HSCs擴(kuò)增部位的初探
　　 目的：E10～E12時(shí)期造血的相關(guān)部位Not

9、ch信號(hào)通路的變化水平及對(duì)胚胎中期HSCs擴(kuò)增部位的初探。
　　 方法：通過實(shí)時(shí)定量PCR連續(xù)觀察E10，E10.5，E11，E11.5和E12心臟內(nèi)皮細(xì)胞和胎肝基質(zhì)細(xì)胞Notch1及Jagged1表達(dá)及變化水平。用流式單標(biāo)檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)心臟和胎肝中c-kit+細(xì)胞比率。將培養(yǎng)24h后的E11心臟懸浮細(xì)胞分別置入由同期的心臟內(nèi)皮細(xì)胞、胎肝基質(zhì)細(xì)胞和AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的共培養(yǎng)體系中，于0h，24h和48h分別檢測(cè)c-kit+細(xì)胞比

10、率，研究各組織基質(zhì)細(xì)胞對(duì)HSCs擴(kuò)增的影響。
　　 結(jié)果：盡管傳代對(duì)心臟貼壁細(xì)胞形態(tài)有影響，但是傳代和原代細(xì)胞中Jagged1和Notch1基因的表達(dá)水平?jīng)]有變化。我們發(fā)現(xiàn)：心臟貼壁細(xì)胞的Jagged1基因在E10.5到最高，跟E10的基因水平相比較，為E10的（5.46±2.2）倍，E11時(shí)的表達(dá)下降，幾乎與E10相同，但是E11.5和E12時(shí)心臟內(nèi)皮細(xì)胞Jagged1表達(dá)均很低，分別為E10的（0.15±0.44）倍和（0.

11、12±0.50）倍。但是胎肝基質(zhì)細(xì)胞Jagged1基因除E11的表達(dá)與E10的心臟內(nèi)皮細(xì)胞相近外，其余胚胎時(shí)期均呈低水平表達(dá)。通過流式檢測(cè)c-kit+細(xì)胞我們發(fā)現(xiàn)，胚胎期心臟和胎肝c-kit+細(xì)胞比率幾乎一致，E11時(shí)c-kit+細(xì)胞明顯增多，分別高達(dá)（12.6±3.2）%和（9.6±2.8）%，但E12時(shí)心臟中c-kit+細(xì)胞明顯減少，僅為（3.4±1.2）%，此時(shí)胎肝中c-kit+細(xì)胞為（11.6±4.1）%。E11的懸浮細(xì)胞與心臟

12、內(nèi)皮細(xì)胞和AGM區(qū)基質(zhì)共培養(yǎng)24h時(shí)，c-kit+細(xì)胞數(shù)量保持穩(wěn)定，但在胎肝基質(zhì)細(xì)胞中c-kit+細(xì)胞數(shù)量明顯減少，在共培養(yǎng)48h，三組中的c-kit+細(xì)胞均呈較低水平，組間沒有顯著性差異。
　　 結(jié)論：心臟內(nèi)皮細(xì)胞中Jagged1基因表達(dá)是變化的，在E10.5時(shí)表達(dá)最高，伴隨著c-kit+細(xì)胞數(shù)量的擴(kuò)增。Notch信號(hào)通路在胎肝中HSCs的發(fā)育并不起主要作用。通過c-kit+細(xì)胞分別與各種同時(shí)期基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，推測(cè)E11胚胎心