新生豬缺氧缺血腦損傷模型多巴胺轉運蛋白PET-CT顯像研究.pdf

1、缺氧缺血性腦病(Hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)是圍產(chǎn)期新生兒最常見的疾病,其中基底節(jié)損傷(Basal ganglia injury,BGI)是HIE的一種常見類型,也是導致兒童腦癱的主要原因之一。
　　 研究表明多巴胺(dopamine,DA)的過度釋放在基底節(jié)對缺氧缺血易損性方面起重要作用。DA作為神經(jīng)遞質(zhì),其水平受多巴胺轉運蛋白(dopamine transporter,DAT)調(diào)控

2、,DAT是定位于多巴胺能神經(jīng)末梢細胞膜上突觸前膜的單胺類特異轉運蛋白,它的功能是將突觸間隙的多巴胺運回突觸前膜,是控制腦內(nèi)DA水平的關鍵因素。因此,Dar的重攝取功能活動將直接影響突觸間隙單胺類遞質(zhì)DA濃度的增高或降低,從而引起多巴胺能系統(tǒng)的功能活動的改變。因此觀察基底節(jié)DAT的變化對BGI有重要意義。
　　 PET的發(fā)明及各種示蹤劑的應用使活體生化功能的研究成為可能。11C-β-CFT作為一種DAT特異性結合劑,主要被紋狀體攝

3、取,是目前對DAT親和力較高的正電子放射性示蹤劑,可以反映DAT在腦內(nèi)神經(jīng)末稍的含量與分布,進而反應DA的含量和分布。11C-β-CFT多巴胺轉運蛋白PET顯像目前廣泛應用于帕金森氏病,但在HIE中的應用研究還未見文獻報道。
　　 我們采用的實驗模型是新生豬全腦缺血模型,即暫時性阻斷雙側頸總動脈30分鐘,同時機械吸入6％的氧氣來制作急性BGI模型。該模型與臨床HIE病變更接近,其病理過程也更接近臨床HIE病理生理。
　　

4、 通過本研究,建立HIE動態(tài)的診斷和治療的動物模型,從分子水平來研究和解釋HIE的病理生理學過程,對臨床窒息新生兒開展超急性期的分子影像學檢查,建立早期HIE的診斷標準,使HIE的影像診斷水平提高到分子水平,為HIE的早期診斷、治療提供客觀依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 一、PET/CT顯像劑的制備部分
　　 1、在線自動化制備顯像劑11C-β-CFT氣相循環(huán)法合成11C-CH3I;0.3ml溶有1mg前體的丙

5、酮在-20℃下吸附11C-CH3I;100℃標記反應3min;冷卻至30℃,加1.5ml去離子水稀釋后上C18柱;在＃5和＃6瓶中加10ml水清洗C18柱;在＃4中加1ml乙醇將11C-CFT淋洗下來;收集瓶中加10ml生理鹽水稀釋。
　　 2、PET/CT腦顯像正常新生豬PET/CT腦顯像:掃描程序采用腦3D采集模式,PET圖像層厚3.25mm。新生豬在戊巴比妥鈉(50mg/kg,腹腔內(nèi))麻醉下頸靜脈注射11C-β-CFT(1

6、.5-2mCi/只)后動態(tài)掃描。對橫斷面圖像進行感興趣區(qū)(ROI)分析,繪制基底節(jié)區(qū)動態(tài)曲線。志愿者PET/CT腦顯像:注射5分鐘后開始采集,采集總時間10分鐘,注射劑量5.6mci。
　　 二、新生豬缺氧缺血腦損傷模型的PET/CT顯像部分
　　 1、新生豬缺氧缺血腦損傷模型的制備選用生后3-5天的健康新生豬25頭,動物分成對照組5頭和模型組20頭。模型制備:用動脈夾阻斷雙側頸總動脈,同時機械通入6％氧氣30分鐘。缺氧

7、缺血后處理:終止缺氧缺血,吸入40％氧氣,同時恢復雙側頸動脈血供,縫合切口。待恢復自主呼吸后停呼吸機。
　　 2、PET/CT掃描掃描程序采用腦3D采集模式,PET圖像層厚3.25mm。在缺氧缺血后0～6h、20～24h、44～48h、68～72h等時間點,新生豬頸靜脈注射11C-β-CFT后立即進行動態(tài)掃描。采集結束后經(jīng)計算機自動處理,重建腦斷層圖像,于注射后30分鐘選取清晰圖像進行分析。在同一層面紋狀體及枕葉設定相同形狀面積

8、的區(qū)域作為感興趣區(qū)(ROI),自動計算ROI放射計數(shù)。每個時間點至少獲得2個腦組織進行病理檢查。
　　 3、組織學檢查麻醉小豬后斷頭取腦,常規(guī)脫水、石蠟包埋、HE染色,在400倍光鏡下觀察大腦皮層、海馬、基底核、斷面的病理學改變,進行病理計分。TUNEL染色觀察細胞凋亡。采用鏈酶菌抗生物素蛋白-過氧化物酶聯(lián)結法(strep tavdinperoxidase-biotin,S-P法)標記多巴胺轉運蛋白(DAT)。每張切片隨機取基底

9、節(jié)區(qū)相互不重疊的5個視野,采用MICROPHOT-FXA型NIKON圖像采集系統(tǒng)攝片,兩個人進行了陽性細胞計數(shù)。
　　 結果：
　　 一、PET/CT顯像劑的制備部分
　　 1、11C-β-CFT的制備從CO2傳到合成器上生產(chǎn)11C-CH3I,nor=β-CFT捕獲11C-CH3I,到粗產(chǎn)品的轉移、純化和洗脫,11C-β-CFT的制備全自動化,從11C-CH3I到可供注射的11C-β-CFT占時3min。最終獲得

10、11C-CFT37mCi。從11C-CO2到最終產(chǎn)物反應時間約為1小時。放化純＞98％,比活度＞370MBq/umol,pH值為7,衰變后溶液符合無菌和無熱原要求。
　　 2、新生豬PET/CT成像結果靜脈注射后5分鐘內(nèi)即可見11C-β-CFT在大腦皮質(zhì)、小腦及基底節(jié)區(qū)域放射性分布較高,腦白質(zhì)放射性分布較低,圖像清晰,左右側放射性濃聚程度顯示對稱;隨著時間延長,大腦皮質(zhì)、小腦放射性明顯減低,而基底節(jié)顯示清晰;而后基底節(jié)的放射性也

11、逐漸消退,影像逐漸模糊。30分鐘后,藥物在腦內(nèi)分布基本穩(wěn)定。
　　 二、新生豬缺氧缺血腦損傷模型的PET/CT顯像部分
　　 1、基底節(jié)腦的病理特點基底節(jié)區(qū)HE染色正常組神經(jīng)元胞漿豐富、核清晰可見、核仁清楚;模型組可見神經(jīng)元嗜酸性變,和或核碎裂、核固縮,可伴有海綿狀變性、層狀或局灶性神經(jīng)元壞死。
　　 2、DAT的改變在正常對照組,紋狀體DAT免疫反應呈若陽性。在模型組,紋狀體DAT表達首先上調(diào),然后下調(diào)。HI后

12、,DAT陽性神經(jīng)元數(shù)量開始增加,在20-24小時組和對照組比較增加有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),接著開始逐漸下降。
　　 3、PET顯像結果HI后,基底節(jié)放射性攝取增加,在0-6和20-24小時組和對照組比較增加有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),接著開始逐漸下降。HI后各時間點免疫組化DAT改變與PET/CT顯像DAT變化呈正相關。
　　 結論：
　　 1、在線自動化制備11C-β-CFT效率高,速度快,放化純高。初