補(bǔ)腎中藥血清孵育促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在腦缺血模型大鼠腦內(nèi)的分化作用觀察.pdf

1、目的：
　　 腦血管疾病是目前危害中老年人身體健康的主要疾病之一, 特別是缺血性腦血管疾病, 大多數(shù)患者留有肢體癱瘓、口眼歪斜、語言功能損傷等不同程度的功能障礙, 嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。近年來，進(jìn)行細(xì)胞移植以替代或修復(fù)受損的腦組織為治療缺血性腦損傷開辟了新的途徑。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是近年來倍受關(guān)注的源于骨髓的細(xì)胞群。BMSCs具有多向分化潛能,易于分離和擴(kuò)增,來源豐富,低免疫源性,可用于異體移植,不

2、存在倫理問題。因此,BMSCs在組織工程、細(xì)胞和基因治療中,尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的再生修復(fù)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 根據(jù)中醫(yī) “腎生精，主骨生髓，通于腦”理論，補(bǔ)腎中藥對(duì)于改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能將具有明顯優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)以Wistar大鼠為研究對(duì)象，在用線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈缺血(MCAO)模型，通過尾靜脈注射移植用維甲酸(RA)及各類補(bǔ)腎中藥血清誘導(dǎo)的BMSCs到大鼠體內(nèi)，觀察所移植的BMSCs進(jìn)入大鼠體內(nèi)后向腦缺血區(qū)遷

3、移，及在腦微環(huán)境作用下繼續(xù)分化的結(jié)果。觀察不同補(bǔ)腎法(補(bǔ)陰、補(bǔ)陽、陰陽雙補(bǔ))及其相應(yīng)中藥代表方（左歸丸、右歸丸、地黃飲子）對(duì)BMSCs在體內(nèi)外向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)效應(yīng)，揭示中醫(yī)“腎生髓”理論的神經(jīng)細(xì)胞學(xué)本質(zhì)，為中醫(yī)藥及BMSCs在防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用提供更為充分的科學(xué)依據(jù)。
　　 方法:
　　 采用貼壁法進(jìn)行BMSCs的培養(yǎng)、提純及擴(kuò)增，并經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行BMSCs的純度鑒定，然后用含有地黃飲子、右歸丸、左歸丸的

4、大鼠含藥血清的培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)孵育，并于移植前48h用BrdU液進(jìn)行BMSCs標(biāo)記。用線栓法制造大鼠大腦中動(dòng)脈缺血(MCAO)模型的制備，符合納入標(biāo)準(zhǔn)的模型大鼠隨機(jī)分為7組，即地黃飲子組、右歸丸組、左歸丸組、維甲酸組、單純細(xì)胞組、模型對(duì)照組及維甲酸組。各治療組于術(shù)后24h經(jīng)尾靜脈注射相應(yīng)含藥血清誘導(dǎo)的BMSCs細(xì)胞懸液。
　　 移植后進(jìn)行大鼠的一般情況、體重變化等的觀察，并于7天、14天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)取大腦標(biāo)本，進(jìn)行HE染色，并用免疫

5、組織化學(xué)方法進(jìn)行神經(jīng)元特異性烯醇酶(neurone specificenolase, NSE)、神經(jīng)巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)及Brdu陽性表達(dá)細(xì)胞的雙重染色。進(jìn)行雙標(biāo)細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)并計(jì)算分化率。
　　 結(jié)果:
　　 術(shù)后 1d時(shí)大鼠毛色不澤，精神差，多臥少動(dòng)，不能主動(dòng)覓食飲水，體重下降較明顯，進(jìn)行BMSCs尾靜脈注射后，未出現(xiàn)明顯反

6、應(yīng)；3d后，大鼠開始主動(dòng)覓食、飲水，體重停止下降，逐漸開始恢復(fù)；7d時(shí)體重恢復(fù)并略超過造模前水平，但各治療組與模型組比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)； 14d大鼠整體狀況好轉(zhuǎn)，體重較7d增加明顯，與模型組比較，各治療組大鼠死亡率及體重變化率有降低趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 HE染色顯示，與假手術(shù)組比較，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠腦組織病理損傷嚴(yán)重，水腫明顯,受損神經(jīng)細(xì)胞多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

7、； 7d時(shí)各治療組病理損傷與模型組相比，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)；14d時(shí)各個(gè)治療組神經(jīng)細(xì)胞病理損傷較模型組減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各14d組大鼠腦組織病理改變較其7d組程度有所減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。
　　 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，各治療組7d及14d組大腦缺血區(qū)邊緣可見有較多量的Brdu標(biāo)記細(xì)胞, 散在分布，并且部分細(xì)胞陽性表達(dá)Nestin, NSE或GFAP。與單純細(xì)胞組比較，地黃飲子

8、組、左歸丸組及維甲酸組Nestin /Brdu雙標(biāo)陽性表達(dá)率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；地黃飲子組及維甲酸組NSE /Brdu雙標(biāo)陽性表達(dá)率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； GFAp/Brdu陽性表達(dá)率在左歸丸組及維甲酸組最為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1. 貼壁法培養(yǎng)純化BMSCs的效果理想，可在短期內(nèi)獲取移植所需的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;經(jīng)靜脈移植BMSCs的方法操作簡(jiǎn)

9、單易行，移植途徑可取。
　　 2. 所移植的BMSCs可以到達(dá)缺血部位，并能在缺血邊緣區(qū)存活,陽性表達(dá)NSE、Nestin、GFAP，提示其可能向神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。
　　 3. 陰陽雙補(bǔ)類代表方地黃飲子可促進(jìn)BMSCs高表達(dá)Nestin和NSE，表明其可能有促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞分化的作用；補(bǔ)陰類代表方左歸丸可促進(jìn)BMSCs高表達(dá)Nestin和GFAP，表明其可能有促進(jìn)BMSCs向