截短型4E-BP2以及藏紅花素對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的影響.pdf

1、研究背景:
　　惡性膠質(zhì)瘤高達(dá)5/10萬(wàn)的患病率,使其在世界范圍內(nèi)仍是一個(gè)難題,其中美國(guó)每年新發(fā)現(xiàn)的患病人數(shù)高達(dá)14000例,我國(guó)每年可達(dá)55000左右,且近年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明惡性膠質(zhì)瘤發(fā)病率呈增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)。其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的比例占到惡性膠質(zhì)瘤的60-70％。雖然各種先進(jìn)的設(shè)備、技術(shù)的應(yīng)用給腫瘤治療帶了福音,但是惡性膠質(zhì)瘤死亡率仍無(wú)下降走勢(shì),有效降低惡性膠質(zhì)瘤的死亡率仍然是世界性的研究熱點(diǎn),因次探究有效地治療措施以提高惡性膠質(zhì)瘤的臨床控制

2、率勢(shì)在必行。
　　近幾年研究顯示,真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程中翻譯起始因子eIFs是起關(guān)鍵作用的一類蛋白分子,其中eIF4E作為治療惡性腫瘤的靶向目標(biāo)日益受到重視。mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯成蛋白質(zhì)是一個(gè)基本的過(guò)程,但是有合理的控制系統(tǒng),主要控制發(fā)生在起始階段。在真核細(xì)胞中,eIF4F復(fù)合物由eIF4E、eIF4A以及eIF4G共同組成,啟動(dòng)具有5'帽子結(jié)構(gòu)的mRNA的翻譯過(guò)程。eIF4E結(jié)合蛋白(eIF4E binding

3、 proteins,4E-BPs)控制著eIF4F復(fù)合物能否成功裝配。4E-BPs的磷酸化水平是其與eIF4E結(jié)合的關(guān)鍵,PTEN/PI3K/AKt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在4E-BPs的磷酸化過(guò)程中起主導(dǎo)作用,同時(shí)需要mTOR對(duì)氨基末端RAIP基序和羧基末端TOS基序的識(shí)別。RAIP基序具有識(shí)別4E-BP2氨基末端以及羧基末端磷酸化位點(diǎn)的功能,而S65以、T70以及雷帕霉素的磷酸化敏感位點(diǎn)由TOS基序識(shí)別。綜上所述,我們考慮同時(shí)剔除RA

4、IP和TOS基序能夠抑制4E-BP2被磷酸化,進(jìn)而阻止eIF4F復(fù)合物的組合,從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并且促進(jìn)凋亡。
　　中醫(yī)藥是祖國(guó)醫(yī)學(xué)的“瑰寶”,也是腫瘤防治研究的一個(gè)重要領(lǐng)域。近年來(lái)研究顯示中草藥藏紅花(Crocus sativus L,Saffron)的有效成分藏紅花素(Crocin)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抗癌活性,且?guī)缀跷窗l(fā)現(xiàn)正常組織細(xì)胞生理功能受到影響,有望成為一種新型的天然抗癌藥物[56,57]。目前有關(guān)藏紅花素對(duì)膠

5、質(zhì)瘤的抗瘤作用及機(jī)制研究,國(guó)際上尚未見相關(guān)報(bào)道,國(guó)內(nèi)僅有個(gè)別報(bào)道[50]。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　刪除4E-BP1cDNA、4E-BP2cDNA中的RAIP和TOS基序編碼序列,構(gòu)建真核表達(dá)載體,其中4E-BP1作為備用。在此基礎(chǔ)上,從分子生物學(xué)水平探索截短型4E-BP2對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的細(xì)胞增殖、凋亡的影響以及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況;探索藏紅花素對(duì)大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及對(duì)凋亡蛋白抑制因子Livin和Survivin表達(dá)的影

6、響。
　　實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果:
　?、庞梅崔D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和分子克隆技術(shù)構(gòu)建截短型4E-BP1、4E-BP2的真核表達(dá)載體,并且利用雙酶切以及測(cè)序的方法鑒定其正確性。結(jié)果顯示插入序列與設(shè)計(jì)序列一直。
　?、仆ㄟ^(guò)MTT法和碘化丙啶(PI)標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增值能力。結(jié)果表明:短型4E-BP2能夠抑制大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的增殖。
　　⑶倒置顯微鏡和Hoehst熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)的變化和凋亡情況;結(jié)果表明:藏紅花素對(duì)膠