烏司他丁對膿毒癥大鼠體內(nèi)MMP-9水平的影響及其肺臟的保護作用.pdf

1、目的：急性肺損傷(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是指心源性以外各種肺內(nèi)外致病因素(嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克等)導(dǎo)致的急性、進行性、頑固性呼吸衰竭。膿毒癥(sepsis)是ALI/ARDS最主要的致病因素，ALI/ARDS是全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SI

2、RS)在肺臟發(fā)生發(fā)展的惡化。ARDS的一個標(biāo)志就是肺泡上皮細胞細胞外基質(zhì)(extracellar matrix，ECM)的破壞，最近的研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)能夠降解ECM，可能促進了急性肺損傷的發(fā)展。MMP-9屬于MMPs家族中的一種，被稱為Ⅳ型膠原酶(也稱明膠酶B)，能夠降解基底膜成分，包括Ⅳ型膠原，纖維結(jié)合素和明膠。MMP-9活性的升高能夠大量的降解肺泡上皮細胞外基質(zhì)

3、，引起急性肺損傷的發(fā)生。 烏司他丁是從人尿中提取出來的一種蛋白酶抑制劑，具有抑制白細胞聚集、抑制白細胞釋放蛋白酶、穩(wěn)定溶酶體膜、抑制過量超氧化物的生成和清除產(chǎn)生的超氧化物、清除氧自由基、抑制炎癥介質(zhì)釋放、減少細胞與組織損傷等藥理作用。 我們推測烏司他丁在急性炎癥打擊比如膿毒癥過程中能夠降低MMP-9的活性，從而減輕肺泡細胞外基質(zhì)的降解。在本實驗研究中，通過對膿毒癥大鼠肺濕干重比、血清MMP-9濃度及肺臟組織MMP-9 m

4、RNA表達水平的影響并結(jié)合肺臟形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的變化，探討烏司他丁對肺臟的保護作用及其作用機制。 方法：本研究應(yīng)用盲腸結(jié)扎穿孔法(cecal ligation and puncture，CLP)復(fù)制嚴(yán)重感染動物模型，選用雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠90只，體重在250-300g之間，分為3組：假手術(shù)組(Sham group，n=30)、鹽水組(NS group，n=30)、烏司他丁組(UTI group，n=30

5、)。假手術(shù)組只開腹，牽拉盲腸但不結(jié)扎；鹽水組行CLP后給予生理鹽水10mL/Kg體重腹腔注射；烏司他丁組行CLP后給予烏司他丁10萬U/Kg腹腔注射，濃度為1萬U/mL。每組動物按時間點分為5個亞組(n=6)，在CLP術(shù)畢0.5h、1.5h、3h、6h和12h觀察大鼠一般情況的變化并處死動物。按時間點處死動物后，3h組留取右肺下葉組織，HE染色法光鏡觀察肺臟形態(tài)學(xué)改變，透射電鏡觀察肺臟的超微結(jié)構(gòu)。留取左肺組織，RT-PCR半定量測定肺組

6、織中MMP-9 mRNA的表達。在6h動物處死后，開胸取右肺中葉，吸干表面水分，再置于85℃烤箱中24小時至恒重，稱干重，計算肺濕干重比(W/D)。通過頸總動脈插管取血2mL，離心后取上清，-80℃保存，ELISA法測定血清中MMP-9的濃度。 數(shù)據(jù)采用SPSS11.5版軟件包(SPSS Company,Chicago，Illinois，USA)進行統(tǒng)計分析，比較肺濕干重比、血清MMP-9濃度及肺組織MMP-9 mRNA表達水平

7、的變化。采用完全單因素的方差分析，方差不齊時采用非參數(shù)的秩和檢驗。P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性，P＜0.01認(rèn)為統(tǒng)計學(xué)上有非常顯著差異。 結(jié)果： 1.CLP術(shù)后一般情況的觀察：假手術(shù)組大鼠蘇醒較早，清醒后活動基本如常，剖腹未見惡臭，腹腔水腫等表現(xiàn)。鹽水組大鼠術(shù)后均有嚴(yán)重的膿毒癥表現(xiàn)：蘇醒延遲，逐漸出現(xiàn)精神萎靡，豎毛及呼吸困難等表現(xiàn)，剖腹可見惡臭味血性滲液，腸管水腫，部分盲腸壞死變黑。與鹽水組大鼠相比，烏司他丁組動物臨床表

8、現(xiàn)較輕。 2.膿毒癥大鼠肺組織濕干重比(W/D)變化：與假手術(shù)組相比，CLP術(shù)后6小時鹽水組肺組織W/D比顯著增加(5.15±0.11 vs 4.54±0.16，P＜0.01)；與鹽水組相比，CLP術(shù)后6小時烏司他丁組肺組織W/D比顯著減少(4.74±0.08 vs 5.15±0.11，P＜0.01)。 3.肺臟形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)變化：HE染色光鏡下觀察到假手術(shù)組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔無水腫，肺泡腔清晰；鹽水組肺泡間

9、隔增寬，肺間質(zhì)充血，水腫，肺泡腔可見大量中性粒細胞浸潤，可見不同程度的肺不張，代償性肺氣腫等；烏司他丁組改變明顯減輕但較假手術(shù)組重。電鏡下觀察假手術(shù)組細胞絨毛、線粒體、板層小體正常；鹽水組Ⅱ型肺泡上皮細胞線粒體大部分嵴，部分膜融合或消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，脫顆?，F(xiàn)象明顯，微絨毛數(shù)量顯著減少，板層小體排空現(xiàn)象明顯；烏司他丁組形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變與鹽水組相比均明顯減輕。 4 大鼠血清MMP-9濃度檢測結(jié)果：與假手術(shù)組相比，鹽水組血

10、清MMP-9濃度在各個時間點均顯著升高(0.5h：2895.8±268.4 pg/ml vs 2090.8±282.1pg/ml，P＜0.01；1.5h：2884.7±176.9pg/ml vs 2292.4±157.0pg/ml，P＜0.01:3h：2986.7±144.5pg/ml vs 2191.4±348.8pg/ml，P＜0.01:6h：3096.3± 384.9pg/ml vs 1 957.3±286.5pg/ml，

11、P＜0.01；12h：2993.1±208.2pg/ml vs 1887.5±176.1pg/ml，P＜0.01)；與鹽水組相比，烏司他丁組血清MMP-9濃度在各個時間點均顯著下降(0.5h:2428.9±166.7 pg/ml vs 2895.8±268.4 pg/ml，P＜0.05；1.5h:2437.5±375.4pg/ml vs 2884.7±176.9 pg/ml，P＜0.05；3h:2520.4±213.1pg/ml vs

12、2986.7±144.5 pg/ml，P＜0.05；6h:2616.4±182.5pg/ml vs 3096.3±384.9 pg/ml，P＜0.05；12h:274.9±148.7pg/ml vs 2993.1+208.2 pg/ml，P＜0.01)；與假手術(shù)組相比，烏司他丁組血清MMP-9濃度在0.5h組、1.5h組和3h組無統(tǒng)計學(xué)差異(0.5h：2428.9±166.7pg/ml vs 2090.8±282.1pg/ml，P＞0.

13、05；1.5h：2437.5±375.4 pg/ml vs 2292.4±157.0pg/ml，P＞0.05；3h：2986.7±144.5 pg/ml vs 2191.4±348.8pg/ml，P＞0.05)，而在6h組和12h組血清MMP-9濃度顯著升高(6h：2616.4±182.5pg/ml vs 1957.3±286.5pg/ml，P＜0.05；12h：274.9±148.7pg/ml vs 1887.5±1 76.0pg/m

14、l，P＜0.01)。 5 大鼠肺組織MMP-9 mRNA表達結(jié)果：與假手術(shù)組相比，鹽水組MMP-9 mRNA表達在各個時間點均顯著增加(3h：0.833±0.115 vs 0.435±0.043，P＜0.01:6h：0.883±0.034 vs0.338±0.035，P＜0.01；12h：0.853±0.023 vs 0.253±0.032，P＜0.01)；與鹽水組相比，烏司他丁組MMP-9 mRNA表達在各個時間點均顯著下降(3h：0

15、.610±0.080 vs 0.833±0.115，P＜0.05；6h：0.470±0.092 vs 0.883±0.034，P＜0.01；12h：0.468±0.013 vs 0.853±0.023，P＜0.01)；與假手術(shù)組相比，烏司他丁組MMP-9 mRNA表達在各個時間點均顯著增加(3h：0.610±0.080 vs 0.435±0.043,P＜0.05；6h：0.470±0.092 vs 0.338± 0.035，P＜