特異性抑制5型磷酸二酯酶通過緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激治療心力衰竭的作用及其機制.pdf

1、研究背景與目的：
　　磷酸二酯酶基因家族（PDE family）在體內(nèi)廣泛分布，有11種亞型。PDE家族的主要功能是水解細胞內(nèi)的第二信使3'，5'-環(huán)狀腺苷酸（cAMP）和（或）3'，5'-環(huán)狀鳥苷酸（cGMP），繼而影響其下游蛋白激酶活性，從而調(diào)控各種生物學效應。目前，作用于PDE的藥物如磷酸二酯酶抑制藥已在臨床上廣泛應用，如治療心血管疾病、肺動脈高壓、勃起功能障礙和哮喘等。
　　在全球范圍內(nèi)，心力衰竭（Heart Fai

2、lure，HF）是威脅人類健康和增加醫(yī)療負擔最主要的疾病之一。有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ER stress）在心力衰竭病人的心肌中被激活，并被證明是心力衰竭發(fā)生和發(fā)展的重要機制。不僅如此，有研究發(fā)現(xiàn)特異性水解cGMP的5型磷酸二酯酶（PDE5）在心力衰竭的病人心肌中表達明顯升高。5型磷酸二酯酶的抑制劑具有明顯的抗心肌肥厚和心力衰竭的作用。而在心肌肥厚及心力衰竭中，5型磷酸二酯酶與內(nèi)

3、質(zhì)網(wǎng)應激的關(guān)系目前尚無報道。本研究通過使用人的心力衰竭的組織標本、心力衰竭的動物模型以及相關(guān)的細胞實驗研究5型磷酸二酯酶與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的關(guān)系。
　　實驗方法與結(jié)果：
　　首先，在人的心力衰竭的組織標本中尋找5型磷酸二酯酶與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的關(guān)系。本實驗用到了4例因擴張型心肌病行心臟移植術(shù)的心臟標本、6例因心力衰竭行二尖瓣置換術(shù)的心臟標本，以及4例因交通事故死亡的正常心臟標本。應用Western blotting的方法檢測這些組織標本

4、中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的激活狀態(tài)和PDE5的表達。結(jié)果顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的效應分子，包括P-PERK、GRP78、XBP1s和CHOP，在心力衰竭的組織樣品中表達都顯著升高。有趣的是，還發(fā)現(xiàn)PDE5在衰竭的心臟組織中的表達也明顯升高，并且PDE5高表達的程度與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志物表達增加的程度明顯相關(guān)。由此說明，在心力衰竭中PDE5的表達與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可能存在相關(guān)關(guān)系。
　　隨后，用異丙腎上腺素（isoproterenol，Iso）和胸主動脈縮窄術(shù)

5、（transverse aortic constriction，TAC）建立了兩種心力衰竭的動物模型。通過形態(tài)學、血流動力學和心臟超聲檢測，發(fā)現(xiàn)PDE5抑制劑能夠明顯緩解Iso和TAC誘發(fā)的心肌肥厚和心力衰竭。為進一步研究抑制PDE5是否能夠緩解心力衰竭中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，本實驗檢測了動物模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的標志物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDE5抑制劑（西地那非）明顯地緩解心力衰竭中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標記物的高表達。嚴重或長期的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激觸發(fā)細胞凋亡，這被認為是

6、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激導致心力衰竭的關(guān)鍵機制。為此，本實驗檢測了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激特異的凋亡蛋白C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）的表達和心力衰竭中凋亡細胞的數(shù)量。研究結(jié)果表明，在心力衰竭動物模型中，PDE5抑制劑能夠明顯抑制CHOP的表達和心肌細胞的凋亡。為進一步明確抑制PDE5對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的作用，用Iso、毒胡蘿卜素（thapsigargin，TG。TG是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜鈣泵抑制劑。它可以促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)鈣清空導

7、致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，是特異性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激刺激劑。）和西地那非干預H9c2（2-1）心肌細胞。結(jié)果顯示，在體外實驗中抑制PDE5同樣可以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激以及其介導的心肌細胞凋亡。
　　此外，還研究了蛋白激酶G（PKG）在PDE5抑制劑抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中的作用。結(jié)果顯示，PKG的抑制劑KT5823和DT3部分扭轉(zhuǎn)了PDE5抑制劑西地那非在心肌細胞中的抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激作用。這提示PKG途徑部分參與了PDE5抑制劑對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的保護作用。肌漿網(wǎng)鈣調(diào)節(jié)蛋白

8、和細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激密切相關(guān)。因此，我們在心力衰竭動物模型中檢測了肌漿網(wǎng)鈣調(diào)節(jié)蛋白肌漿網(wǎng)（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）鈣泵2a（sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase2a，SERCA2a）和受磷蛋白（phospholamban，PLB）的表達。結(jié)果顯示，抑制PDE5扭轉(zhuǎn)了心力衰竭動物模型心肌中SERCA2a和磷酸化的PLB（P-PLB）的表達下調(diào)。這提示，PDE5抑制劑可能是通過對SERCA2a和P-PLB表達

9、的調(diào)控從而發(fā)揮其抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的作用。為進一步明確其具體作用機制，本研究運用PLB的野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒（16位絲氨酸→丙氨酸）確定PLB16位絲氨酸在PDE5抑制劑抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激效應中起關(guān)鍵作用。
　　結(jié)論：
　　綜上所述，在心力衰竭的動物模型中特異性抑制PDE5可以明顯改善心臟功能，并且能夠明顯緩解心力衰竭中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。抑制PDE5治療心力衰竭的機制可能是通過其抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的作用實現(xiàn)的。這為PDE5抑制劑用于心力衰竭的治