間充質(zhì)干細(xì)胞對骨肉瘤的趨向性及促進(jìn)其生長和轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、目的： 文獻(xiàn)報(bào)告間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)與腫瘤細(xì)胞之間存在復(fù)雜的相互作用。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞與骨肉瘤細(xì)胞混合后接種于裸鼠脛骨髓腔，形成的腫瘤明顯大于骨肉瘤細(xì)胞單獨(dú)接種時(shí)。本研究擬在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過荷瘤鼠尾靜脈注射報(bào)告基因標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞，探討其對骨肉瘤病灶的趨向性及對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響，并初步探討間充質(zhì)干細(xì)胞對骨肉瘤趨向及影響骨肉瘤生長的機(jī)制。 方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng)：建立骨肉瘤動(dòng)物模型的人骨肉瘤

2、細(xì)胞（Saos-2）購于中科院上海生命科學(xué)研究院，置于37℃、5％CO2 培養(yǎng)箱中，用含10％胎牛血清和1％雙抗的α－MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，三天后按照1：3的比例傳代。hMSCs 分離自年輕正常人的骨髓，采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)，用含10％FBS和1％雙抗的α－MEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，三天后按照1：3的比例傳代。采用3～4代的hMSCs，在hMSCs 90％融合后滴加用α－MEM 培養(yǎng)液稀釋的攜帶綠色熒光蛋白（GFP）基因的腺病毒液4 ml轉(zhuǎn)染過

3、夜（MOI＝150），換液后繼續(xù)培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察hMSCs轉(zhuǎn)染GFP基因的效率。 2. 骨肉瘤動(dòng)物模型的建立及分組：29 只4周齡健康雄性裸鼠，購于中科院上海生命科學(xué)研究院。23 只裸鼠向裸鼠右后脛骨近端骨髓腔內(nèi)注射50 μl Saos-2細(xì)胞懸液（107個(gè)），建立原發(fā)性骨肉瘤動(dòng)物模型；4周后骨肉瘤病灶明顯時(shí)按隨機(jī)化原則分為2組，A組（OS組，n=11）、B組（OS+hMSCs組，n=12）。未建立骨肉瘤動(dòng)物模型的6 只動(dòng)

4、物作為C組（hMSCs組，n=6）。A組動(dòng)物作為陽性對照組，形成腫瘤后繼續(xù)觀察，不作任何處理；B、C組動(dòng)物經(jīng)尾靜脈注射50 μl 106個(gè)GFP標(biāo)記的hMSCs懸液（GFP-hMSCs），作為實(shí)驗(yàn)組及陰性對照組。 3. 動(dòng)物模型的觀察和檢測:（1）裸鼠體重和腫塊生長情況。于接種Saos-2細(xì)胞后第4周開始，每周測量一次裸鼠體重及腫瘤部位腫塊長和寬，按照文獻(xiàn)報(bào)告的方法計(jì)算腫瘤體積大小，繪制裸鼠體重和腫瘤體積的生長曲線。（2）A、B

5、組裸鼠血清中ALP活性檢測。于第12周時(shí)用0.5％戊巴比妥鈉（0.1 ml/10g）腹腔麻醉裸鼠，經(jīng)裸鼠心臟部位取血，離心后取血清用p-NPP法測量比較兩組裸鼠血清中ALP的活性。（3）腫瘤部位的X 線檢查。12周取材時(shí)分離各只裸鼠的患肢，X 線檢查腫瘤對骨組織的破壞情況。（4）12周取材時(shí)分離裸鼠的腫瘤組織和肺組織，X 線檢查完畢后，一半進(jìn)行冰凍切片，直接熒光顯微鏡下觀察并利用GFP抗體、SDF-1 抗體、CCL5 抗體行免疫組織化學(xué)

6、檢測；一半用福爾馬林溶液固定，脫鈣后行常規(guī)HE 染色觀察腫瘤的形成、對骨質(zhì)的破壞情況及肺臟轉(zhuǎn)移情況。 4.體外分析SDF-1/CXCR4 信號通路在間充質(zhì)干細(xì)胞對骨肉瘤趨向中的作用：利用細(xì)胞免疫化學(xué)及western blot 分別檢測hMSCs和Saos-2 上是否有SDF-1 及CXCR4 陽性表達(dá)。SDF-1 Elisa 試劑盒測定間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基、Saos-2細(xì)胞條件培養(yǎng)基中SDF-1的表達(dá)量，利用SDF-1中和抗體

7、阻斷條件培養(yǎng)基中SDF-1的表達(dá)，利用transwell 裝置檢測不同培養(yǎng)液對hMSCs 及Saos-2細(xì)胞遷移能力的影響。 5.體外分析CCL5/CCR5 通路在間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和生長中的作用：利用細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測hMSCs 上是否有CCL5 表達(dá)，western blot檢測Saos-2細(xì)胞上是否有其受體CCR5 表達(dá)。利用transwell 裝置和MTT 方法檢測hMSCs上清對Saos-2細(xì)胞遷移和增殖

8、能力的影響，以及CCL5中和抗體阻斷后細(xì)胞遷移和增殖能力的變化。 結(jié)果： 1.外源性的間充質(zhì)干細(xì)胞可以趨向到骨肉瘤部位：冰凍切片的裸鼠腫瘤組織在鏡下可見有綠色熒光。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)腫瘤組織局部有GFP的陽性表達(dá)，提示hMSCs 趨向并整合到了腫瘤組織內(nèi)。 2.間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)骨肉瘤生長和轉(zhuǎn)移：間充質(zhì)干細(xì)胞注射后8周，OS+hMSCs組的腫瘤體積明顯大于OS組，且注射hMSCs 后裸鼠體重明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

9、（P<0.05）；血清ALP水平在OS+hMSCs組也明顯高于OS組。X 線片證實(shí)OS+hMSCs組裸鼠骨肉瘤部位骨組織破壞程度明顯高于OS組。肺組織切片證實(shí)OS+hMSCs組裸鼠肺轉(zhuǎn)移率明顯高于OS組（P<0.01）。以上結(jié)果提示間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)骨肉瘤生長和轉(zhuǎn)移。 3. SDF-1/CXCR4 信號途徑調(diào)節(jié)hMSCs 向Saos-2細(xì)胞的遷移：細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示Saos-2細(xì)胞上有SDF-1 陽性表達(dá)，western b

10、lot 證實(shí)hMSCs 上有CXCR4 陽性表達(dá)。利用SDF-1中和抗體阻斷條件培養(yǎng)基中SDF-1的表達(dá)可以明顯降低hMSCs及Saos-2細(xì)胞的遷移能力（P<0.01）。 4. 間充質(zhì)干細(xì)胞通過CCL5/CCR5 信號途徑促進(jìn)Saos-2細(xì)胞的遷移和生長：細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示hMSCs 上有CCL5 陽性表達(dá)，western blot 證實(shí)Saos-2細(xì)胞上有CCR5 表達(dá)。間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基可以顯著促進(jìn)Saos-2細(xì)胞的