水稻稻瘟病害拮抗鏈霉菌原生質(zhì)體融合育種研究.pdf

1、稻瘟病對水稻生產(chǎn)危害極大，傳統(tǒng)上化學(xué)防治已不能適應(yīng)綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展要求，近年采用生物防治已成為主要研究方向。除了從土壤等環(huán)境中篩選稻瘟病菌的拮抗菌外，對已有拮抗菌株通過基因重組方法實現(xiàn)菌種改良也成為重要的研究方向。原生質(zhì)體融合技術(shù)在細胞水平上進行微生物菌種改良。其理論基礎(chǔ)是基因重組。近年來利用該技術(shù)，有效選育到許多抗生素生產(chǎn)菌。其優(yōu)點是不受親緣關(guān)系影響，遺傳信息傳遞量大，不需要了解雙親菌株詳紐遺傳背景，可以有目的的選擇親株以選育理想菌株。

2、 刺孢吸水鏈霉菌北京變種 (streptomyces hygrospinosus vat. beijingensis)，由中國農(nóng)科院從棉花根部土壤分離。其所產(chǎn)抗生素農(nóng)抗120，是一種廣譜性抗真菌的核苷類抗生素，對花卉、經(jīng)濟農(nóng)作物真菌病害有較好的防治效果。淡紫灰鏈霉菌(streptomyce lvendule)產(chǎn)N-糖苷類抗生素——中生菌素，對農(nóng)作物真菌病害也有廣譜性防治效果。采用原生質(zhì)體融合技術(shù)融合這兩個母本菌株優(yōu)良特性，篩選稻瘟

3、病強拮抗菌。 通過對甘氨酸濃度、酶解溫度、酶濃度、酶解時間等影響因素考察，及正交試驗優(yōu)化，確定了刺孢吸水鏈霉菌和淡紫灰鏈霉菌原生質(zhì)體制備的最佳條件。 實驗結(jié)果表明，刺孢吸水鏈霉菌最佳原生質(zhì)體制備條件是：甘氨酸濃度為0.5％，酶解溫度28℃，溶菌酶濃度為3 mg/ml，酶作用時間60min；淡紫灰鏈霉菌：甘氨酸濃度為1.0％，酶解溫度32℃，溶菌酶濃度4 mg/ml，酶作用時間60min。有效的原生質(zhì)體保存條件是：-20℃

4、，在5天內(nèi)，原生質(zhì)體再生率在15％以上。 通過原生質(zhì)體融合育種方法，刺孢吸水鏈霉菌和淡紫灰鏈霉菌原生質(zhì)體融合，經(jīng)染色體融合重組得到一批穩(wěn)定的重組體，從中篩選強拮抗稻瘟菌菌株。融合體篩選標記，刺孢吸水鏈霉菌一方選擇抗鏈霉素性，其鏈霉素最小抑制濃度(MIC)是33μg/mL；淡紫灰鏈霉菌原生質(zhì)體選擇原生質(zhì)體滅活法，設(shè)置紫外滅活組和熱滅活組，其中紫外輻射滅活最低時間選擇60S，熱滅活選擇55℃水浴下的最小時間是105min，得到100

5、％致死原生質(zhì)體。兩親本菌株原生質(zhì)體經(jīng)40％PEG促融，紫外滅活組得到融合體381株，熱滅活組得到78株。相比較，紫外滅活組比熱滅活組得到更多抗鏈霉素融合體。隨機選擇50株融合體經(jīng)自然分離得到557株較穩(wěn)定重組子。平板對峙實驗表明，重組子中拮抗稻瘟病菌的能力是親本菌株刺孢吸水鏈霉菌拮抗能力的30％～60％的，占總分離子的0.16；60％～110％的占0.69；在110％以上的占0.15。其中，編號RH103菌，相對拮抗能力在167％以上。

6、其拮抗稻瘟病菌菌絲擴散生長、稻瘟菌孢子萌發(fā)，稻瘟菌絲黑色素化的提早，均比親本顯著。 對通過原生質(zhì)體融合篩選的重組菌株和親本菌株生理生化特性研究結(jié)果表明：重組菌株在PDA、高氏一號、和葡萄糖天門冬素培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征近似親本刺孢吸水鏈霉菌，但其菌絲相比親本不太茂盛，產(chǎn)孢子量少。在不同培養(yǎng)基上發(fā)酵液效價存在差別，但差別不大。相比發(fā)酵成本考慮，發(fā)酵培養(yǎng)基3性價比高。重組菌株相比親本刺孢吸水鏈霉菌，效價提升30％以上。組分分析結(jié)果表明：