利用原生質(zhì)體融合技術改良重寄生鏈霉菌F46和鏈霉菌SC1.pdf

1、本試驗利用原生質(zhì)體融合技術將重寄生鏈霉菌F46和鏈霉菌SC1融合，以期得到整合雙親優(yōu)良特性于一體的生防菌。本論文主要包括以下4部分： 1.采用傳統(tǒng)鑒定方法和現(xiàn)代分子分類方法對親本菌株F46和SC1進行了鑒定。菌株F46與灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)同源性較高，為98％，二者培養(yǎng)特征和生理生化特性雖有差異，但更具有許多相似之處，因此將其歸入灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)。菌株SC1與灰

2、色輪絲鏈霉菌(Streptomycesgriseoverticillatus)同源性為99％，雖然二者在培養(yǎng)特征和生理生化特性方面存在著某些差異，我們認為該菌株應當歸入灰色輪絲鏈霉菌(Streptomycesgriseoverticillatus)。 2.確定了雙親原生質(zhì)體形成與再生的最佳條件：菌株F46、SC1采用二次菌絲培養(yǎng)，即在蔗糖含量20％菌絲培養(yǎng)液里，25℃條件下150rpm培養(yǎng)48h；然后按15％的接種量轉(zhuǎn)接到蔗糖含

3、量30％，甘氨酸含量分別為1％、15％的菌絲培養(yǎng)液中，同樣條件下，繼續(xù)培養(yǎng)48h；在34℃條件下，菌株F46用等量混合的蝸牛酶和溶菌酶20mg·mL-1，菌株SC1用10mg·mL-1溶菌酶，分別酶解3h、2.5h，不僅有大量的原生質(zhì)體形成，且再生率也高。研究發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體不宜在4℃條件下長期保存。菌株F46和SC1的原生質(zhì)體最適宜的紫外滅活時間分別為600s、360s；在60℃條件下，二者最適宜熱滅活時間分別為45min、90min。按

4、不同的組合方式，將雙親的原生質(zhì)體等量混合，經(jīng)40％PEG助融10min，培養(yǎng)再生，獲得40株融合子。 3.經(jīng)皿內(nèi)拮抗試驗初篩，發(fā)酵液活性測定復篩，獲得3株在不同方面優(yōu)于親本的融合子：FSf-11、FSf-13和FS-30。其中融合子FSf-11和FSf-13是由菌株F46的原生質(zhì)體熱滅活與菌株SC1原生質(zhì)體未滅活融合而來；融合子FSf-30通過雙親滅活原生質(zhì)體(F46熱滅活與SC1紫外滅活)融合后獲得。皿內(nèi)拮抗試驗表明：融合子F

5、Sf-11、FSf-13對灰葡萄孢的抑制效果顯著，其抑制機理主要引起灰葡萄孢的基內(nèi)菌絲嚴重畸變、縊縮或原生質(zhì)凝聚等；FS-30對粉紅聚端孢的抑制作用比親本SC1也有所增強，除引起粉紅聚端孢的基內(nèi)菌絲嚴重畸變外，還有菌絲細胞壁消解現(xiàn)象。 4.3株融合子在形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特性上均與雙親存在明顯差異，融合子的抗藥性、生長速度和產(chǎn)孢量等方面也明顯不同于雙親。在以親本菌株F46和SC1為對照的情況下，利用16SrDNAPCR-