microRNA-21在大鼠心肌缺血再灌注早期的抗凋亡作用及機(jī)制.pdf

1、目的:細(xì)胞凋亡是缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷的重要環(huán)節(jié)，抑制細(xì)胞凋亡可以防止或減輕I/R損傷。文獻(xiàn)報道m(xù)icroRNA-21（miR-21）在I/R動物模型表達(dá)異常，本研究探討miR-21在I/R早期表達(dá)異常是否與細(xì)胞凋亡相關(guān)及其可能機(jī)制。曲美他嗪(trimetazidine，TMZ)是經(jīng)典抗缺血藥物，本研究還將探討TMZ在I/R早期抗細(xì)胞凋亡作用是否由miR-21及其靶基因介導(dǎo)。
　　方法:

2、
　　1.體內(nèi)實驗:48只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)、I/R2h、I/R4h、I/R6h組，每組12只大鼠。Sham組大鼠僅開胸，其余組分別開胸結(jié)扎前降支45分鐘后再灌注2h、4h、6h。比較各組的細(xì)胞凋亡水平及miR-21水平，以Bcl-2/Bax、Caspase-3為心肌細(xì)胞凋亡指標(biāo)。HE染色觀察心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，Westernblot方法檢測Bcl-2/Bax、Caspase-3的蛋白水平，Realtime PCR檢

3、測miR-21變化。
　　2.體內(nèi)miR-21過表達(dá)實驗:成功構(gòu)建重組腺相關(guān)病毒rAAV9-ZsGreen-pre-miR-21及空白對照病毒，滴度為5.0×1012vg/ml。30只SD大鼠，隨機(jī)分為
　?、賹φ战M:大鼠轉(zhuǎn)染空白病毒;
　?、趍iR-21組:大鼠轉(zhuǎn)染rAAV9-ZsGreen-pre-miR-21;
　　③Sham組:大鼠轉(zhuǎn)染空白病毒后開胸;
　?、躀/R組:大鼠轉(zhuǎn)染空白病毒后I/R2h;

4、
　?、軮/R+miR-21組:大鼠轉(zhuǎn)染rAAV9-ZsGreen-premiR-21后I/R2h。以PTEN/AKT通路作為擬驗證的miR-21的下游通路。比較過表達(dá)miR-21后絀胞凋亡水平及miR-21下游通路水平變化。Realtime PCR方法檢測miR-21、PTENmRNA水平，免疫組化觀察缺血區(qū)Bcl-2、Bax、 Caspase-3的表達(dá)，Westernblot方法檢測缺血區(qū)凋亡指標(biāo)水平及下游通路PTEN、p-A

5、KT的蛋白水平。
　　3.體外實驗:用LipofectamineTM2000將30nM，50nM，100nM的miR-21抑制劑(inhibitors)及30nM，50nM，100nM的miR-21模擬物(mimics)轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞，摸索最佳轉(zhuǎn)染濃度。將細(xì)胞隨機(jī)分為
　　①Vehicle Control(VC)、
　?、谝种莆镪幮詫φ?inhibitorsnegative control，INC)、
　?、勰?/p>

6、擬物陰性對照(mimics negative control，MNC)、
　?、苋毖?復(fù)氧(hypoxia-reoxygenation，H/R)+VC、
　　⑤H/R+INC、
　?、轍/R+MNC、
　?、逪/R+inhibitors、
　?、郒/R+mimics。H/R處理為低氧培養(yǎng)4小時后常氧培養(yǎng)3小時。比較正、負(fù)調(diào)控miR-21表達(dá)時miR-21、下游通路PTEN/AKT水平及細(xì)胞凋亡水平的變化。R

7、ealtime PCR檢測miR-21，PTENmRNA水平，Westernblot方法檢測Bcl-2/Bax，Caspase-3，PTEN，p-AKT的蛋白水平，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。
　　4.體外TMZ抗凋亡實驗:H9C2細(xì)胞隨機(jī)分為Control、H/R+Control、H/R+TMZ組;同時另設(shè)H/R+TMZ+INC、H/R+TMZ+inhibitors組。觀察TMZ對H/R后細(xì)胞miR-21、下游通路PTEN/AKT水

8、平及細(xì)胞凋亡水平的影響，進(jìn)一步觀察miR-21表達(dá)抑制后上述指標(biāo)的變化。
　　結(jié)果:
　　1.與Sham組比較，I/R2h，4h，6h組大鼠心肌缺血區(qū)miR-21進(jìn)行性降低(P＜0.05)，抑制凋亡指標(biāo)Bcl-2/Bax水平降低（P＜0.05），促凋亡因子Caspase-3水平逐漸升高(P＜0.05)。非缺血區(qū)miR-21表達(dá)增高(P＜0.05)。
　　2.SD大鼠過表達(dá)miR-21時PTEN(·) mRNA表達(dá)水平未

9、明顯變化(P＞0.05)，但PTEN蛋白水平下降(P＜0.01)。與I/R組比較，過表達(dá)miR-21使I/R組大鼠miR-21表達(dá)升高、PTEN下降、p-AKT水平升高(P＜0.05)，抑制凋亡的Bcl-2/Bax升高、促凋亡因子Caspase-3表達(dá)降低(P＜0.05)。
　　3.與VC組比較，H/R可使Bcl-2/Bax降低，Caspase-3升高，細(xì)胞凋亡率升高(P＜0.05);與H/R+INC組比較，miR-21表達(dá)抑制進(jìn)

10、一步降低Bcl-2/Bax水平，促進(jìn)Caspase-3表達(dá)，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高(P＜0.05);與H/R+MNC組比較，miR-21過表達(dá)可以升高Bcl-2/Bax水平、抑制Caspase-3水平，降低細(xì)胞凋亡率（P＜0.05）。
　　4.與H/R+Control組比較，H/R+TMZ組可以升高Bcl-2/Bax、抑制Caspase-3水平，改善細(xì)胞凋亡率(P＜0.05);但與H/R+TMZ組比較，抑制miR-21表達(dá)則使Bcl

11、-2/Bax降低，Caspase-3升高，細(xì)胞凋亡率升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.在I/R早期大鼠心肌缺血區(qū)miR-21表達(dá)隨再灌注時間延長進(jìn)行性下降，并伴隨細(xì)胞凋亡進(jìn)展。
　　2.rAAV9在大鼠心臟可以持久、高效表達(dá)，作用安全。
　　3.過表達(dá)miR-21可改善心肌細(xì)胞凋亡，抑制miR-21表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　4.miR-21通過PTEN/AKT信號通路調(diào)控I/R早期細(xì)胞凋亡。