川香29水稻香味基因定位、分子標記輔助育種和基因表達分析.pdf

1、水稻是全球半數(shù)多人口的主食，隨著人們生活水平的日益提高，消費者對稻米品質(zhì)也提出了更高要求。水稻香味是高檔優(yōu)質(zhì)米的一個重要品質(zhì)性狀；香稻米質(zhì)優(yōu)良，香味馥郁，兼具食療保健作用，愈來愈受到消費者的青睞和市場歡迎。本文以優(yōu)良秈稻保持系川香29B(或其恢復(fù)系29R)為香味供體親本，美國光身粳稻Lemont、R2(由Lemont選育而來)、美B、P18和G46B為受體親本，對川香29香味性狀進行了遺傳分析、基因定位、分子標記輔助選擇及基因芯片等多方

2、面的分析，主要結(jié)果如下： 1.川香29B香味遺傳分析與基因定位 1.1水稻葉片香味氫氧化鉀法鑒定 香味是感官性狀，其表型鑒定受到外界氣候環(huán)境諸多影響。以有香味親本和無香味親本為對照，對其后代分離群體用氫氧化鉀法鑒定葉片香味。通過在不同時間、地點和氣候環(huán)境下多年試驗，發(fā)現(xiàn)用氫氧化鉀法鑒定水稻葉片香味的最佳時機為雨過天晴后的上午，溫度在20～26℃，該時期兩對照親本鑒別的準確率在99％以上，后代分離單株香與不香性狀表

3、現(xiàn)非常明顯。 1.2川香29B香味性狀遺傳分析 川香29B/Le，29B/R2兩組合雜交種F1種子經(jīng)咀嚼米粒香味鑒定沒有香味，其F1植株葉片也均表現(xiàn)沒有香味，即川香29B香味性狀受隱性基因控制；在這兩個F2群體中，經(jīng)X2測驗，無香味單株與極端香味單株分離比符合3:1，該結(jié)果由相應(yīng)F2:3家系香味表型進一步得到驗證，表明川香29B香味性狀受一對單隱性基因控制。 1.3香味基因分子標記定位 在均勻分布予水稻1

4、2條染色體上700對SSR引物中，有268對在29B與Lemont存在多態(tài)性，多態(tài)性頻率為38.29％。其中位于第8染色體上的RM23097、RM515、RM8264、RM7049、RM7356和RM7556等標記與香味性狀存在連鎖。本研究開發(fā)SSR標記Aro1和Aro7在這兩親本間也存在多態(tài)性，香味基因fgr被定位在SSR標記Aro7(0.57cM)和RM515(0.71cM)之間。在29B/R2F2群體中，將香味基因fgr定位于RM

5、23120(0.52cM)和RM3459(1.23cM)兩標記之間。 2.分子標記輔助選育香稻保持系與恢復(fù)系 2.1香味基因連鎖標記基因型鑒定 前人報道的香味基因連鎖標記RM223、和SCU-Rice-SSR-1在本研究親本29B與Lemont中不存在多態(tài)性，RM42存在多態(tài)性但不與香味性狀連鎖。本研究所鑒定與香味基因連鎖的8個標記在來自不同區(qū)域的13個香稻品種中基因型存在差異，因而對于香味基因的分子標記輔助選擇

6、，需要根據(jù)不同的香稻材料，確定選用的連鎖標記及其對應(yīng)的基因型。 2.2水稻香味的ISSR分析 從40條ISSR引物中篩選到的24個用于對目前生產(chǎn)應(yīng)用較多的23份香稻與非香稻材料進行檢測，共檢測到208個多態(tài)性片段，擴增帶的分子量在100～2200bp區(qū)間。不同引物擴增出的清晰多態(tài)條帶數(shù)在5～16條之間(表2)，擴增出5～9條的引物有16個，占66.7％；擴增出10～16條的引物有8個，占33.3％，平均每個引物擴增到8.

7、67個多態(tài)性帶；ISSR標記能將23份水稻完全區(qū)分開。推測ISSR標記812中多態(tài)性條帶(1050bp左右)可能與水稻香味性狀有關(guān)。 2.3分子標記輔助選育香稻保持系與恢復(fù)系 以川香29B(或其恢復(fù)系29R)為供體親本，無香味恢復(fù)系P18和無香味保持系美B分別為受體輪回親本，獲得P18/29R的F1和美B/29B組合的F2。用與香味基因緊密連鎖的兩側(cè)標記RM23120和RM3459在P18/29R組合中選擇香味純合基因型

8、單株；Aro1和RM3459在美B/29B組合中選擇香味純合基因型單株；同期進行農(nóng)藝性狀香味表型選擇和遺傳背景分析。此后經(jīng)過成都正季和海南南繁一年兩季，連續(xù)回交；獲得一批目標基因純合且農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的優(yōu)良香稻保持系和恢復(fù)系。 3.水稻香味的基因芯片分析 3.1有香味與無香味近等基因池差異基因 從29B近等基因系(NIL)BC6F3群體中選擇遺傳背景完全相同，只在目標基因型存在差異的有香味與無香味單株，其分蘗期葉片分

9、別等量混合用于芯片分析。在第8染色體目標區(qū)域，芯片在有香味與無香味近等基因池檢測到4個差異基因：AT3G48170(geneid)參與氨基乙酸、絲氨酸和蘇氨酸新陳代謝；AT4G27070和AT5G54810參與苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；AT4G34030參與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的分化降解。其中AT3G48170即為前人報道的sk-2香味基因，也是本研究分子標記定位區(qū)域的基因。 在分子功能(Go)和生物過程(Path

10、way)方面，芯片在水稻全基因組共檢測到23個(不包括重復(fù))差異基因。這些基因是一些轉(zhuǎn)錄啟動激活、DNA控制的RNA酶活性和應(yīng)激反應(yīng)因子，主要參與生理生化調(diào)控和硫化物新陳代謝。進一步RT-PCR分析驗證了該芯片結(jié)果的可靠性。 3.2水稻香味機理及生化途徑 根據(jù)芯片結(jié)果，結(jié)合前人研究及生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)膽堿是香味主基因sk-2調(diào)控中的重要物質(zhì)。而膽堿(Choline)是維生素B復(fù)合體之一，該物質(zhì)在水稻籽粒中主要存在谷殼和

11、籽粒表面，從而找到了水稻米粒香味主要分布在表面的原因。 在香稻材料中，BADH2基因第7外顯子發(fā)生8個堿基的缺失與3個單核苷酸多態(tài)性，使終止密碼子提前出現(xiàn)，BADH2基因不再編碼甜菜堿脫氫酶(Betaine-aldehydedehydrogenase，BADH)，引起甜菜堿醛(Betainealdehyde)到甜菜堿(Glycinebetaine)氧化過程的終止。生成的甜菜堿醛便在膽堿脫氫酶(cholinedehydrogena