補陽還五湯抗動脈粥樣硬化炎癥機制及對炎性細胞因子表達譜的影響.pdf

1、隨著社會的發(fā)展和生活水平的提高，感染性疾病所導致的死亡不斷減少，而動脈粥樣硬化疾病導致的死亡迅速增多，目前已成為全球人口死亡的首位原因。高熱量、高飽和脂肪酸食物攝入過多以及缺乏體力活動等不良生活方式是其元兇。 動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是缺血性心臟病、腦血管病等心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)?？箘用}粥樣硬化藥的應(yīng)用，對防治心腦血管疾病具有重要的戰(zhàn)略意義。雖然人類認識動脈粥樣硬化是一種疾病并對其發(fā)病機制進行相關(guān)研

2、究也有100余年的歷史，而AS的發(fā)病機制至今尚未明確。隨著動脈粥樣硬化研究的不斷深入，AS中新的細胞因子不斷檢出，使炎癥已成為AS發(fā)生發(fā)過程中的重要因素。特別是炎癥標志物，高敏C-反應(yīng)蛋白（1 s-CRP），白細胞介素-1（IL-8），可溶性粘附因子（sICAM-1），P-選擇素（P-selsctin）、可溶性血管細胞粘附因子（sVCAM-1），整合素（Dll/CD18等均在動脈粥樣硬化中有表達并發(fā)揮作用。 從中醫(yī)臨床來說，雖然

3、沒有動脈粥樣硬化的概念，但根據(jù)病因，臨床表現(xiàn)，并發(fā)癥等特征，散見于中醫(yī)“胸痹”“中風”，“眩暈”，“頭痛”，“痰證”，“瘀證”等的記載中，但不單指一種病?？偛C可概括為為本虛標實之證，本虛為脾虛，心脾虛，腎虛，標實為氣滯，血瘀，痰濁。治療多以活血化瘀、消食化痰、利水滲濕、補虛扶正為大法。中醫(yī)藥對于抗動脈粥樣硬化機制的研究具有多層次，多角度，多靶點的特征，主要從調(diào)節(jié)血脂紊亂、保護血管內(nèi)皮、抑制血栓形成和抑制i缸管平滑肌增殖、抗炎、抗氧化、

4、改善血流變等途徑。補陽還五湯是晚清名醫(yī)王清任所創(chuàng).主治中風后遺癥中屬正氣虧虛而致血脈不利者?，F(xiàn)代研究證明，補陽還五湯有改善血液流變學，降血脂，抗血栓，改善心肌缺血，抗動脈粥樣硬化，對周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)等作用。而其對于氣虛血瘀心腦血管病已獲得醫(yī)學界的重視。但抗動脈粥樣硬化藥理機制研究尚缺乏系統(tǒng)的認識。 目的: 本研究擬采用載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因敲除小鼠（ApoE-/-）復(fù)制模型，研究中

5、藥復(fù)方補陽還五湯對動脈粥樣硬化的防治作用，同時利用蛋白液相芯片系統(tǒng)研究動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)以及補陽還五湯干預(yù)后炎癥細胞因子的表達譜變化，并采用蛋白遷移率實驗及蛋白凝膠實驗等分子生物技術(shù)初步驗證細胞因子的信號轉(zhuǎn)導通路，闡述動脈粥樣硬化的炎癥形成機制和補陽還五湯的作用機理，為臨床治療動脈粥硬化引起的心腦血管病提供理論基礎(chǔ)。 方法: 24只雄性Apo E-/-小鼠隨機分為3組，每組8只，分別為模型組（Apo E-/-+高脂），

6、補陽還五湯組（Apo E-/-+高脂+補陽還五湯），舒降之組（Apo E-/-+高脂+舒降之），并以8只雄性C57BL/6J（Apo E-/-小鼠來源于C57BL/6J）作為空白對照組.所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后，模型組，舒降之組，補陽還五湯組高脂飼料喂養(yǎng)造模。補陽還五湯組灌服補陽還五湯口服液，每日一次；舒降之組給予辛伐他汀灌胃，每日一次，其他組灌服等劑量生理鹽水。連續(xù)灌胃14周。 造模造模后，眼球取血，分離血清，酶法檢測血脂四項

7、。取出心臟和主動脈，并將其再分成兩部分，一部分沿心房尖間劃線形成的平面切除下面部分，再放入10%中性福爾馬林溶液中固定，一部分放入-80℃冰箱中保存。 福爾馬林溶液固定后的心肌組織常規(guī)石蠟包埋、切片。從心臟向血管的方向連續(xù)切片。從主動脈瓣出現(xiàn)到消失，即主動脈竇區(qū)域。HE染色或油紅0染色觀察各組的病理變化。 使用LiquiChip蛋白液相芯片系統(tǒng)檢測組織細胞因子，LINCO公司的試劑盒可以同時檢測mIL-1α、mlL-1β

8、、mlL-、mIL-5、mIL-6、mIL-7、mIL-9、mIL-10、mlL-12p70、 mIL-13、 mIL-15. mIL-17、 mIFN-γ、 mTNF-α、mGM-CSF、mMIP-1a、mMCP-1、mKC、mRA TES、mIP-10、mG-CSF。 部分心肌組織用Western及IP細胞裂解液提取心肌組織蛋白，Bradford法進行蛋白定量，進行蛋白（）跡實驗。以β-actin為內(nèi)參，將處理好的蛋白質(zhì)樣品

9、進行SDS-PAGE分離，電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后，孵育一抗和二抗，ECL顯色，Kodak Image Station2000MM成像系統(tǒng)采集圖像，獲得圖像用圖像處理軟件Image Tool3.0測定并分析條帶平均積光密度值以檢測p38、ERK和JNK及其磷酸化蛋白P-p38、P-ERK和P-JNK的表達水平。 部分心肌用核蛋白漿蛋白提取試劑盒提取核蛋白，Bradford法進行蛋白定量，進行凝膠蛋白遷移率試驗

10、（EMSA）。處理好樣品SDS-PAGE分離，加樣前預(yù)電泳，加樣電泳直至酚藍達到凝膠頂部3/4處停止，然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，加入ECL試劑柯達2000MM圖像工作站成像。 結(jié)果: 1、補陽還五湯對動脈粥樣硬化模型病理變化的影響，飼喂高脂飼料飲食，14周后處死動物，取心臟和主動脈，在主動脈根部的相對應(yīng)區(qū)域進行切片，保證樣本之間的可比性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組斑塊形成明顯，動脈腔顯著變小，補陽還五湯顯著降低AS斑塊形成，與模型組有差

11、異顯著。 2、補陽還五湯對apoE-/-小鼠血脂的影響檢測血脂四項，結(jié)果發(fā)現(xiàn)補陽還五湯對血脂的影響與對照組相比減少無顯著意義（P>0.05），舒降之與其他組比較，減少有顯著性意義（P<0.001）。說明舒降之能顯著的降低甘油三酯（TG）和膽固醇（CHOL）、升高HDL的作用。這與在大鼠和小鼠上的報道并不一致，可能與apoE基因缺失有關(guān)。 3、IiquiChip蛋白液相芯片系統(tǒng)檢測組織細胞因子顯示：與空白組比較，模型組（M

12、-CSF、IL-1、IL-6、IL-6和TNFa均增加有顯著性意義（P<0.001）。而與模型組比較，補陽還五湯組TNFα表達減少有顯著性意義（P<0.001）；舒降之組與模型組比較IL-1β和IL-6表達減少有顯著性意義（P<0.001）；二者與模型組比較GM-CSF減少和IL-10表達增加有顯著性意義（P<0.001）。 4、補陽還五湯對MAPK家族成員p38、ERK和JNK及其磷酸化蛋白P-p38、P-ERK和P-JNK的

13、表達的影響。通過分析結(jié)果中目的條帶圖像發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯對p38及其磷酸化蛋白的表達影響與其他組比較減少無顯著性意義（P>0.05）；模型組ERK和JNK，P-ERK和P-JNK表達相對與其他組均增加有顯著性意義（P<0.001）。與模型組相比，補陽還五湯減少有顯著性意義（P<0.001）。說明補陽還五湯能降低此二者及其磷酸化水平的表達，可能是其調(diào)節(jié)細胞因子表達的機制之一。 5、補陽還五湯對NF-κB活化的影響。應(yīng)用Pierce的

14、Lightshift chemiluminescent EMSA Kit，通過分析結(jié)果中目的條帶圖像發(fā)現(xiàn)，高脂飼料能夠引起動脈粥樣硬化模型小鼠NF-κ B的活化，模型組與空白對照組相比，增加有顯著性意義（P<0.001）。而與模型組比較，補陽還五湯及舒降之組均減少具有顯著性差異（P<0.001）?？赡転橐种芅F-κB活化降低了某些細胞因子的轉(zhuǎn)錄，可能是補陽還五湯抑制AS炎癥的重要機制。 結(jié)論: 1、補陽還五湯可明顯減輕動

15、脈粥樣硬化的損傷程度，對動脈粥樣硬化的組織結(jié)構(gòu)具有明顯的保護作用。 2、補陽還五湯和舒降之均能通過降血脂的作用而減輕動脈粥樣硬化的危險因素。 3、動脈粥樣硬化時，炎癥細胞因子的表達譜發(fā)生明顯改變，補陽還五湯能明顯影響部分炎癥細胞因子的表達。 4、通過蛋白水平的驗證，補陽還五湯明顯降低ERK和JNK以及兩者磷酸化水平的表達，可能是其調(diào)節(jié)細胞因子表達的機理之一。 5、apoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化模型中NF