柯薩奇病毒A組16型分離鑒定及感染C57乳鼠致病模型的研究.pdf

1、手足口病(Hand-foot-mouthDisease,HFMD)是嬰幼兒時期常見的傳染病,以發(fā)熱和手足口部出現(xiàn)皰疹為主要特征,輕者可以自愈,重者可合并腦炎、無菌性腦膜炎、肺水腫等,甚至死亡。1957年首例HFMD在多倫多被報道,第2年從HFMD患兒標(biāo)本中分離出CVA16病毒,1972年,美國加利福尼亞州爆發(fā)的HFMD疫情,分離出了EV71病毒。自此以來,世界范圍內(nèi)每年都會發(fā)生該病的流行,常以大范圍散發(fā)、局部爆發(fā)的形式存在,發(fā)病率和死亡

2、人數(shù)逐年攀升。我國1981年自上海首次發(fā)現(xiàn)HFMD病例[1,2],HFMD在全國范圍內(nèi)迅速蔓延,其中天津于1983年、1986年兩次發(fā)生HFMD爆發(fā)流行,1998年中國臺灣省爆發(fā)的HFMD共監(jiān)測到129106病例,死亡78例,2011年全國累計報告手足口病病例1496048例,其中重癥17775例,死亡467人。據(jù)統(tǒng)計每隔2~3年就有一次大流行,每年的感染病例在100萬以上[3]。2008年5月2日衛(wèi)生部將HFMD納入丙類法定傳染病[4

3、],HFMD已成為危害我國社會安全的重大公共衛(wèi)生問題。
　　引起HFMD的病原體有20多種,CVA16和EV71是主要的病原體。EV71感染常常并發(fā)病毒性腦膜炎、腦炎、肺水腫、肺出血等嚴(yán)重并發(fā)癥,可導(dǎo)致嬰幼兒的快速死亡,故對于EV71的相關(guān)報道較多。且據(jù)往年的資料顯示,EV71在中國大部分地區(qū)的重癥發(fā)病率大于CVA16。因此,中國對于HFMD的研究主要集中于EV71,包括藥物及疫苗的研究。相對EV71而言,CVA16所致的HFMD

4、癥狀較溫和,且較少發(fā)生并發(fā)癥,在以往的研究中常作為HFMD的輔助檢測項目。但近年有報道,CVA16可能與心肌炎、難治性休克等致死性并發(fā)癥相關(guān)。在中國近年的HFMD流行中,CVA16的發(fā)病率有升高的趨勢,在某些地區(qū)甚至超過EV71成為優(yōu)勢血清型。從發(fā)病時間和地區(qū)來看,形成CVA16和EV71交替或混合共流行的局面。且在臨床中二者的感染不易區(qū)分。因此,加強對我國不同地區(qū)CVA16的病毒分離鑒定、致病機制及疫苗研究對防控HFMD具有重要意義。

5、
　　目的：分離鑒定我國不同地區(qū)引起HFMD流行的柯薩奇病毒A組16型(CoxsackievirusA16,CVA16)病毒株,建立流行株感染乳鼠動物模型,為深入探索CVA16病毒致病機制,以加速預(yù)防疫苗研制、藥物篩選進程奠定基礎(chǔ)。
　　方法：(1)從我國北京、天津、山東、福建等地收集147份HFMD臨床樣本,用Vero細(xì)胞分離病毒,并進行RT-PCR鑒定,對CVA16的基因及毒力特點做出分析;(2)將CVA16分離株經(jīng)過蝕

6、斑純化、乳鼠適應(yīng)后,獲得一株能致死11日齡C57乳鼠的CVA16毒株,命名為TS10/08(GenBankJX068829)。隨后將TS10/08感染11日齡C57乳鼠,觀察并記錄感染乳鼠體重變化、臨床得分及死亡率變化,并通過實時定量RT-PCR測定腦、骨骼肌、肺、心肌的病毒載量,檢測組織病理、炎癥分子變化,建立CVA16感染乳鼠模型。
　　結(jié)果：(1)從我國不同地區(qū)來源的147份HFMD臨床樣本中,成功分離出16株CVA16、2

7、0株EV71、5株CVA16和EV71混合感染株,測定CVA16滴度是10-5~10-9,進一步測定7株CVA16的全基因組序列,并提交至GenBank,基于VP1核苷酸序列構(gòu)建進化樹,結(jié)果顯示全部分離株都屬于C1亞型,均為我國主要流行株;(2)將TS10/08CVA16病毒株腹腔注射感染1~14日齡C57乳鼠,結(jié)果顯示,該TS10/08CVA16病毒株可致死11日齡內(nèi)C57乳鼠,測定病毒毒力為50LD50/mL。對TS10/08CVA

8、16感染乳鼠測定病毒載量,顯示感染后骨骼肌中病毒載量持續(xù)高于心肌、肺、腦中,而心肌、肺、腦中病毒載量差別不大。6天發(fā)病高峰時做病理檢測,發(fā)現(xiàn)骨骼肌、心肌、腦、肺中都有淋巴細(xì)胞浸潤,但骨骼肌中最為嚴(yán)重,且CVA16病毒感染期間MCP-1,MIP-1alpha,CSF3和MIP-1beta炎性分子顯著升高,推測炎性分子在CVA16感染HFMD中發(fā)揮著重要作用。
　　結(jié)論：從147份HFMD臨床樣本中分離得到了16株CVA16流行病毒株