復(fù)方大黃素組合抗柯薩奇病毒和皰疹病毒的研究.pdf

1、柯薩奇病毒(CV)和人類單純皰疹病毒(HSV)都是人類病毒性疾病的致病病原，目前國內(nèi)外治療單純皰疹病毒的藥物以阿昔洛韋及其衍生物的應(yīng)用最為廣泛，但該類藥物存在毒副作用大，價(jià)格昂貴等許多不足；到目前為止，國內(nèi)外還沒有較好的針對(duì)柯薩奇病毒的治療藥物。前期研究發(fā)現(xiàn)大黃素具有一定的抗CVB3和HSV-I的活性，因此對(duì)大黃素進(jìn)行深入研究。但是大黃素存在一些問題：一是水溶性差；二是存在較高的細(xì)胞毒性；三是可能存在疑似的致畸和誘導(dǎo)突變作用。為解決這幾

2、個(gè)問題，本課題從三個(gè)方面著手：第一，根據(jù)制劑的原理，用輔料PEG6000將大黃素制備成分散體系；第二，根據(jù)中藥配伍減毒增效的原理，用姜黃素和苦參堿與大黃素進(jìn)行配伍，篩選出高效低毒的最佳組合；第三，通過藥物有效成分提取工藝的優(yōu)化，降低整體藥物組合的動(dòng)物毒性。 采用正交設(shè)計(jì)方法，將大黃素、姜黃素、苦參堿三種成分按一定比例進(jìn)行配伍，以藥物抗病毒的治療指數(shù)(TI)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較各組藥物的細(xì)胞毒性和抗病毒作用的效力，結(jié)果顯示單純大黃素對(duì)

3、Hep-2細(xì)胞的毒性作用最大，通過配伍，細(xì)胞毒性可降低10倍左右；所有中藥組合都沒有阻止CVB3病毒吸附到細(xì)胞上的作用，但是對(duì)于已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的CVB3病毒的生物合成則都有一定的抑制作用，其中大黃素：姜黃素：苦參堿為2：0：1的這一組TI為最高；各組藥物都有直接殺死CVB3病毒的作用，其中TI最高的藥物組合是大黃素：姜黃素：苦參堿為2：1：2。輔料既無細(xì)胞毒性也無抗病毒的效力，對(duì)整個(gè)試驗(yàn)不產(chǎn)生影響，陽性對(duì)照藥物阿昔洛韋既無細(xì)胞毒性也無抗

4、病毒的效力。 抗HSV-I的體外試驗(yàn)選擇vero細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)原理和方法與前面一致。結(jié)果顯示大黃素對(duì)vero細(xì)胞的毒性作用最大，通過配伍，細(xì)胞毒性可降低11倍左右；阻止病毒吸附在細(xì)胞上作用最強(qiáng)的藥物組合是大黃素：姜黃素：苦參堿為1：2：2與大黃素：姜黃素：苦參堿為2：1：2；直接殺死病毒TI最高的是純品苦參堿；抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)生物合成TI最高的藥物組合為大黃素：姜黃素：苦參堿為2：0：1。陽性對(duì)照藥物阿昔洛韋，沒有阻止病毒對(duì)細(xì)胞的吸

5、附作用，但具有一定的抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)生物合成和直接殺死病毒的作用。大黃素經(jīng)過配伍后三種作用途徑都能發(fā)揮作用，強(qiáng)于阿昔洛韋。 本課題在細(xì)胞篩選的基礎(chǔ)上，選擇4＃深入進(jìn)行了抗CVB3感染小鼠保護(hù)作用的研究。首先建立了CVB3感染的小鼠模型，染病小鼠在24h后開始治療。連續(xù)15天灌胃治療。試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)復(fù)方大黃素藥物組合治療后的染病小鼠發(fā)病癥狀明顯減輕，死亡率下降；治療組的小鼠心、肺、腎等組織中病毒滴度均低于陽性對(duì)照組和模型對(duì)照組，

6、說明該組合能抑制CVB3病毒在心、肺、腎等臟器中的增殖；治療組的小鼠心、肺、腎等組織切片的熒光反應(yīng)不明顯，熒光點(diǎn)顯著少于陽性對(duì)照組和模型對(duì)照組，這也說明該組合對(duì)小鼠臟器具有較強(qiáng)的保護(hù)作用；從小鼠臟器中提取病毒mRN，PCR擴(kuò)增凝膠電泳分析中同樣可以看出高、中劑量組中沒有擴(kuò)增出病毒DNA，說明病毒在高、中劑量組中得到了抑制。同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果說明CVB3病毒不在肝組織中繁殖增生，肝細(xì)胞對(duì)該病毒不易感。陽性對(duì)照阿昔洛韋沒有抗CVB3病毒的作用，也

7、不能保護(hù)小鼠免受病毒的侵入。 比較了大黃素、苦參堿純品和提取物以及他們的配伍組合的小鼠急性毒性。發(fā)現(xiàn)大黃素和苦參堿在高劑量時(shí)對(duì)小鼠存在較大的急性毒性，但在較低劑量時(shí)無影響，提取物的毒性則明顯低于純品，LD50分別提高了3～4倍；并且兩種藥物成分無論是純品還是提取物，經(jīng)過配伍后小鼠的急性毒性顯著下降。結(jié)果說明，用有效部位提取物代替純化合物可極大降低藥物的整體動(dòng)物毒性。蓄積毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)方大黃素組合沒有蓄積毒性；孕鼠致畸敏感期試

8、驗(yàn)結(jié)果顯示，該藥物組合在安全劑量內(nèi)沒有致畸的副作用。 復(fù)方大黃素組合物中，用提取物代替純化合物可以極大地降低組合物的整體動(dòng)物毒性，說明提取工藝的不同會(huì)導(dǎo)致藥物組合的毒性具有差異，因此提供工藝和質(zhì)量穩(wěn)定就成了至為關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)。大黃素的最佳提取工藝為虎杖藥材加80％的乙醇回流提取3次，每次8倍量的溶劑提取時(shí)間1.5h，得到粗提取物后進(jìn)行一系列純化，可得含大黃素提取物；苦參總堿的提取工藝為苦參藥材加60％的乙醇回流提取3次，每次6倍

9、量的溶劑，提取時(shí)間1.5h，可得苦參總堿粗提取物。利用離子交換樹脂法用0.5％的稀鹽酸處理苦參總堿，pH值12的氨水堿化，三倍柱體積80％乙醇洗脫得到較純苦參總堿。采用HPLC測定含量，大黃素的色譜條件為流動(dòng)相乙腈：0.1％磷酸(80：20)、檢測波長254nm，苦參堿的色譜條件為流動(dòng)相乙腈：無水乙醇：3％磷酸(70：15：15)、檢測波長220nm；姜黃素的色譜條件為流動(dòng)相甲醇：0.6％醋酸(75：25)、檢測波長428nm。規(guī)定復(fù)方