Lamininα5在肺腺癌及A549細胞系不同增殖狀態(tài)中的表達.pdf

1、前言：
　　全世界每年因惡性腫瘤死亡的病人高達500萬，腫瘤已經(jīng)成為當今威脅人類健康的主要疾病。研究證實腫瘤組織中的血管較正常組織豐富。目前發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)血管生成不僅對腫瘤的生長至關重要，而且對腫瘤的轉(zhuǎn)移也發(fā)揮重要作用，腫瘤的轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要致死病因之一。
　　腫瘤細胞穿越基底膜是轉(zhuǎn)移的關鍵，基底膜是由層粘連蛋白（Laminin，LN）、Ⅳ型膠原、巢蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖等組成的網(wǎng)狀結構，其中層粘連蛋白是主要成分。完整的層粘

2、連蛋白是由細胞分泌到細胞外，由α、β、γ三條鏈組成的異構三聚體，分子量從400kDa到900kDa不等;到目前為止，共發(fā)現(xiàn)5種類型的α鏈、4種類型的β鏈、3種類型的γ鏈，有19種組合形式，在機體各組織中廣泛表達，諸如血管內(nèi)皮和平滑肌細胞。層粘連蛋白調(diào)控周圍血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的黏附、增殖、分化、遷移和凋亡，從而對血管再生和其空間結構的維持發(fā)揮重要作用。層粘連蛋白在人體隨著時間的變化，在不同組織有不同種表達形式。目前研究表明:人血管內(nèi)

3、皮細胞僅表達兩種層粘連蛋白:LN411(即Lamininα4β1γ1)和LN511(即Lamininα5β1γ1)。所有的內(nèi)皮細胞各個階段都表達LN411，其α4G域被抗體封閉時就能觸發(fā)內(nèi)皮細胞依賴線粒體的程序性細胞死亡，這表明LN411對內(nèi)皮細胞的生存是必需的;而LN511只有在生后3-4周的毛細血管和小靜脈的內(nèi)皮細胞基底膜上出現(xiàn)，并且促血管生成的病理因素（如促炎因子TNFα）能夠上調(diào)其表達，說明LN511或在血管新生過程中起重要作用

4、。
　　LN511的膜受體包括整合素受體（Integrin）和非整合素受體(如Lutheran bloodgroup glycoprotein)，以整合素為主。內(nèi)皮細胞膜上表達幾種整合素受體，其中整合素α3β1為LN511的主要特異性受體。LNα5是LN511的亞基。LN511的許多生物學功能都是通過LNα5來實現(xiàn)的，因為它包含與細胞受體相互作用的主要位點。無論是胚胎鼠還是幼鼠，LNα5基因敲除后會表現(xiàn)出多種組織器官發(fā)育缺陷，如顱

5、腦畸形，并指，腎小球基底膜、腎小管毛細血管網(wǎng)形成障礙等。這些結果表明LNα5在組織器官的發(fā)育和發(fā)展中具有多重功能。有意思的是，LNα5同樣也是一個調(diào)節(jié)腫瘤黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移的多功能黏附蛋白。一方面，LNα5與腫瘤細胞表面的整合素受體結合，促進腫瘤細胞的黏附;另一方面，LNα5與腫瘤細胞表面的一類非整合素受體(Lutheran blood group glycoprotein)結合，促進腫瘤細胞的遷移，有利于腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，事實上整合素受體

6、與非整合素受體是一種競爭性地關系。研究表明在乳腺、甲狀腺、卵巢、前列腺等組織上的惡性腫瘤高表達LNα5，我們通過免疫組化發(fā)現(xiàn)LNα5在肺癌、腎癌、腸癌、胰腺癌等腫瘤組織中也呈現(xiàn)高表達（圖1，2）。那么這些腫瘤細胞與LNα5之間的關系又如何呢？我們擬以肺腺癌A549細胞系為例進行研究。
　　本實驗通過檢測LNα5在肺腺癌組織中的表達，從蛋白和mRNA水平上研究LNα5的表達與A549細胞（肺腺癌細胞）的細胞不同增殖狀態(tài)間的關系，觀察

7、表達LNα5的A549細胞的細胞周期。為肺腺癌的臨床診斷和治療提供新的實驗依據(jù)。
　　方法：
　　人體組織標本腎癌與其癌旁組織，肺癌與其癌旁組織，結腸癌與其癌旁組織，胰腺癌與其癌旁組織，及其它組織切片均來源于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，經(jīng)中國醫(yī)科大學倫理委員會批準及供者知情同意。A549細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。
　　A549細胞實驗分組:
　　當A549細胞在直徑為3cm的培養(yǎng)皿中長到約6

8、0％時，即絕大部分細胞呈現(xiàn)梭形，處于伸展狀態(tài)，樹突明顯突起為A組;當A549細胞在直徑為3cm的培養(yǎng)皿中長到約80％-90％時，即細胞數(shù)量較多，產(chǎn)生接觸抑制為B組。
　　1.免疫組織化學法---檢測LNα5在人類腫瘤組織及其癌旁組織中的表達。
　　2.蛋白質(zhì)免疫印跡法---檢測LNα5在肺腺癌及A、B組A549細胞中的表達。
　　3.流式細胞術法---檢測A、B組A549細胞的細胞周期及LNα5的表達。
　　4.

9、免疫熒光法---檢測LNα5在A、B組A549細胞中的表達。
　　5.RT-PCR法---檢測LNα5在A、B組A549細胞中的mRNA量。
　　結果：
　　1.LNα5在結腸癌與其癌旁組織，胰腺癌與其癌旁組織，肺癌與其癌旁組織，腎癌與其癌旁組織中均表達，與癌旁組織相比，LNα5在癌組織中高表達，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　2.肺腺癌及其癌旁組織均表達LNα5，與癌旁組織相比，LNα5在肺腺癌組織中高

10、表達，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　3.A組A549細胞有45％-50％的細胞處于S期，60％-65％的細胞處于非G1期;而B組A549細胞僅有18％-25％的細胞處于S期，25％-35％的細胞處于非G1期。表達LNα5的S期A549細胞高達60％-90％，非G1期A549細胞高達85％-95％。
　　4.蛋白水平:與B組A549細胞相比，LNα5在A組A549細胞中高表達，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。

11、>　　5.mRNA水平:與B組A549細胞相比，LNα5在A組A549細胞中mRNA含量明顯高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　結論：
　　1.LNα5在癌組織高表達或具有普遍性，如結腸癌，胰腺癌，肺腺癌，腎癌等。
　　2.LNα5在肺腺癌組織中高表達，同時在體外肺腺癌A549細胞中發(fā)現(xiàn)當A549細胞處于非G1期時表達增加。LNα5是新生血管必需的胞外基質(zhì)，處于增殖旺盛期的肺腺癌細胞合成分泌LNα5，為肺腺癌血