ec-SOD基因修飾的BMSCs對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用的研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　據(jù)2012中國(guó)衛(wèi)生年鑒的統(tǒng)計(jì),我國(guó)因心血管疾病的死亡率位于各類疾病之前列,在城市為257.41/10萬,占總死亡率的19.51％,在農(nóng)村為128.13/10萬,占17.45%。盡管隨著溶栓療法、經(jīng)皮腔內(nèi)冠脈介入治療等的策略優(yōu)化,心肌梗死的早期死亡率有明顯降低,但是,缺血再灌注損傷導(dǎo)致的遠(yuǎn)期心力衰竭和死亡仍然居高不下,近年來對(duì)其有效地防治策略研究越來越被人們重視。氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS

2、)是一種高活性分子產(chǎn)生與機(jī)體清除或者修復(fù)能力失衡的表現(xiàn),其通過過氧化物和氧自由基的產(chǎn)生破壞細(xì)胞的各組成部分,造成細(xì)胞毒性破壞細(xì)胞正常的氧化還原狀態(tài),直接參與動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷、心臟衰竭的發(fā)生發(fā)展。因此有效降低氧化應(yīng)激損傷,是早期預(yù)防和治療心肌缺血再灌注減低死亡率的關(guān)鍵策略之一。
　　細(xì)胞外超氧化物歧化酶1982年由Marklund等首次發(fā)現(xiàn)并命名,是超氧化物歧化酶家族中的一種。超氧化物岐化酶是一種抗氧化酶,它可以將兩

3、個(gè)自由基歧化為H2O和O2。細(xì)胞外超氧化物歧化酶不僅存在于細(xì)胞外環(huán)境,而且在一些特定的組織如心臟,血管,肺組織,腎臟和胎盤等中高表達(dá),其生理學(xué)功能主要是保護(hù)大腦、心臟和其他組織免受氧化應(yīng)激損傷,減少細(xì)胞和組織損傷。
　　基因治療是在1972年首次提出[1],以基因工程技術(shù)為手段,導(dǎo)入目的基因修復(fù)異常的基因或使其表達(dá)相應(yīng)的蛋白治療疾病的一類新型技術(shù)。1990年,美國(guó)FDA批準(zhǔn)首個(gè)基因治療實(shí)驗(yàn)治療重癥綜合免疫缺陷(severe com

4、bined immunodeficiency,SCID)[58]。自此,已進(jìn)行了超過1700項(xiàng)有關(guān)基因治療的臨床試驗(yàn)。雖然早期臨床失敗導(dǎo)致許多對(duì)基因治療的質(zhì)疑,但近年來治療視網(wǎng)膜疾病萊伯氏先天性黑朦(retinal disease Leber's congenital amaurosis)[59-62],SCID[63]和帕金森氏病[64]等臨床試驗(yàn)的成功為基因治療帶來新的希望。研究證實(shí)通過直接注射ec-SOD病毒載體過表達(dá)ec-SOD

5、可以減少心肌頓抑和梗死面積。但因作用時(shí)間較短和直接注射病毒的安全性而限制了其臨床應(yīng)用。
　　本研究擬在體外細(xì)胞水平,探討ec-SOD(extracellular superoxide dismutase,細(xì)胞外超氧化物歧化酶)修飾的BMSCs(bone marrow mesenchymal stem cells,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)對(duì)缺氧復(fù)氧條件下乳鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)以及潛在作用機(jī)制,以期找尋找抗心肌氧化應(yīng)激損傷的新治療策略。

6、r>　　方法：
　　第一部分:乳鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定與BMSCs的分離培養(yǎng)鑒定:通過差速貼壁法獲得乳鼠心肌細(xì)胞,采用cTnI免疫熒光染色鑒定乳鼠心肌細(xì)胞的分離效率;通過貼壁法獲得BMSCs,通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)鑒定BMSCs的表面標(biāo)志物。
　　第二部分:觀察ec-SOD修飾的BMSCs對(duì)H/R條件下CMs(cardiomyocytes,心肌細(xì)胞)的保護(hù)作用:1.將CMs分為4組:A常氧對(duì)照組(不做缺氧復(fù)氧干預(yù));B缺氧對(duì)照組

7、(單純進(jìn)行缺氧復(fù)氧干預(yù));C條件培養(yǎng)組(將ec-SOD修飾的BMSCs培養(yǎng)48h的培養(yǎng)基加入CMs并進(jìn)行缺氧復(fù)氧干預(yù));D共培養(yǎng)組(將ec-SOD修飾的BMSCs置于transwell小室中與CMs共培養(yǎng)并進(jìn)行缺氧復(fù)氧干預(yù));檢測(cè)1.Elisa法檢測(cè)ec-SOD修飾的BMSCs分泌ec-SOD蛋白的水平;2.MTT法檢測(cè)H/R條件下CMs的存活率;3.TUNEL法檢測(cè)CMs的凋亡率。
　　第三部分:探討ec-SOD修飾的BMSCs

8、對(duì)H/R條件下CMs的保護(hù)作用機(jī)制:將CM分為4組:A常氧對(duì)照組;B缺氧對(duì)照組;C條件培養(yǎng)組;D共培養(yǎng)組;檢測(cè):1.DHE染色檢測(cè)ROS的含量;2.Western blot檢測(cè)ec-SOD修飾的BMSCs作用后CMs中p38MAPK和p-p38MAPK表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:
　　1.乳鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)后第3d,在倒置相差顯微鏡下可見細(xì)胞伸出偽足相互接觸交織成網(wǎng),呈放射狀排列的同心圓狀,搏動(dòng)呈同步性,搏動(dòng)頻率多在100/m

9、in~120/min;cTnI染色鑒定呈陽(yáng)性。BMSCs經(jīng)培養(yǎng),倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞長(zhǎng)梭形、成纖維狀,排列較緊密;經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定,其表面標(biāo)志物CD44、CD90陽(yáng)性、CD34、CD45陰性。
　　2.ec-SOD修飾的BMSCs通過分泌ec-SOD,可明顯增加CMs在缺氧復(fù)氧損傷后的存活率和減少CMs的凋亡。
　　3.ec-SOD修飾的BMSCs能夠明顯減少CMs間的ROS含量,進(jìn)而減少CMs在缺氧復(fù)氧損傷后的p38MA