hHO-1基因修飾的豬BMSC旁分泌保護(hù)心肌細(xì)胞體外缺氧-復(fù)氧損傷的初步研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 目前已有多項(xiàng)基礎(chǔ)和臨床研究證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)移植可修復(fù)受損心肌、顯著改善心肌梗死后心功能，但由于不適應(yīng)缺血缺氧、炎癥、凋亡因子等惡劣的宿主環(huán)境，移植細(xì)胞的90％以上在短期內(nèi)死亡，這大大降低干細(xì)胞在心肌損傷修復(fù)中的效果，因此，選擇合適的基因?qū)SC進(jìn)行修飾可能是提高細(xì)胞的移植存活率和治療效果的一條有效途徑。
　　 血紅素加氧酶-1(HO-1)參與的保護(hù)機(jī)制包括減輕內(nèi)毒素、多種細(xì)胞炎癥因

2、子、金屬等誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。其反應(yīng)終產(chǎn)物CO、膽紅素也被證實(shí)具有抗氧化、抗凋亡的作用。這都表明HO-1不僅通過(guò)自身反應(yīng)體系發(fā)揮保護(hù)作用，更能借助多種化學(xué)信號(hào)通路的交互影響產(chǎn)生其他諸如旁分泌細(xì)胞因子、保護(hù)性信號(hào)通路激活、線(xiàn)粒體功能介導(dǎo)等多重保護(hù)作用。通過(guò)轉(zhuǎn)基因模式獲得一定程度的HO-1過(guò)表達(dá)，在上述臨床情況下無(wú)疑擁有重要的治療前景。
　　 大量前期研究已證實(shí)，腺病毒介導(dǎo)hHO-1基因(Ad-hHO-1)心肌內(nèi)注射能有效地抑制心臟

3、缺血-再灌注損傷、減輕缺血性心力衰竭。本課題旨在研究腺病毒介導(dǎo)的HO-1基因修飾對(duì)骨髓MSC的抗缺氧存活率以及通過(guò)旁分泌作用對(duì)體外模擬缺氧/復(fù)氧心肌損傷的保護(hù)，明確HO-1基因修飾MSC移植治療急性心肌梗死可行性和有效性，為將旁分泌“雞尾酒”療法運(yùn)用于臨床研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.采用位點(diǎn)特異性重組(Adeasy)系統(tǒng)，構(gòu)建HO-1重組腺病毒載體。用293細(xì)胞擴(kuò)增、氯化艷密度梯度離心法純化Ad-HO-1

4、，TCID50法測(cè)病毒滴度。
　　 2.采用Percoll密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法分離培養(yǎng)MSC。探索并選用最佳感染強(qiáng)度轉(zhuǎn)染BMSC，穩(wěn)定傳代BMSC-HO-1。體外研究轉(zhuǎn)染HO-1基因?qū)δ康牡鞍妆磉_(dá)、MSC細(xì)胞增殖及多向分化能力的影響。
　　 3.運(yùn)用TUNEL法體外研究BMSC-HO-1在缺氧、去血清條件下對(duì)抗凋亡能力的變化。差速傳代分離培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞，換用不同處理下的干細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察缺氧/

5、復(fù)氧過(guò)程中的心肌細(xì)胞活力變化以及對(duì)SAPK/JNK信號(hào)通路的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.構(gòu)建hHO-1重組腺病毒載體目的基因測(cè)序正確，PCR鑒定排除野毒結(jié)果。在293細(xì)胞中大量擴(kuò)增攜帶hHO-1的重組腺病毒，經(jīng)氯化艷密度梯度超速離心后獲得的病毒滴度約2×1010pfu/ml；
　　 2.Ad-HO-1感染MSC的最佳強(qiáng)度為100pfu/cell，蛋白表達(dá)持續(xù)至少13天。hHO-1基因轉(zhuǎn)染對(duì)MSC的細(xì)胞增殖能力

6、、多向分化潛能無(wú)顯著影響。較MSC細(xì)胞相比，缺氧-去血清培養(yǎng)24小時(shí)后MSC-HO-1的細(xì)胞損傷明顯減輕，培養(yǎng)12小時(shí)的凋亡指數(shù)顯著降低。
　　 3.缺氧12h時(shí)，經(jīng)過(guò)缺氧處理后的空白載體修飾干細(xì)胞培養(yǎng)基、正常氧濃度以及缺氧處理下的HO-1修飾干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的活力心肌細(xì)胞數(shù)較多，且與對(duì)照培養(yǎng)基的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.而復(fù)氧2h后，只有缺氧條件下的HO-1修飾干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的活力心肌細(xì)胞數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。復(fù)氧、再

7、血清化1h后P-JNK的變化與基線(xiàn)對(duì)照組、空白載體組相比均出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的降低。
　　 結(jié)論：
　　 1.成熟的病毒載體構(gòu)建、擴(kuò)增和純化技術(shù)可獲得高滴度、安全、高效的HO-1重組腺病毒載體。
　　 2.腺病毒載體介導(dǎo)HO-1基因可高效轉(zhuǎn)染MSC，穩(wěn)定表達(dá)目的基因，持續(xù)時(shí)間適中，對(duì)MSC的生長(zhǎng)增殖及分化能力無(wú)明顯影響，是適宜的基因轉(zhuǎn)移載體。
　　 3.HO-1基因轉(zhuǎn)染后的BMSC可以有效對(duì)抗缺氧去血清導(dǎo)致的