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文檔簡(jiǎn)介
1、急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(acute lung injury/acuterespiratory distress syndrome,ALI/ARDS)是多種病因引起的以進(jìn)行性呼吸困難、低氧血癥、呼吸膜及血管內(nèi)皮損傷為特征的臨床急危重癥。研究表明早期的急性炎癥瀑布反應(yīng)及其繼發(fā)的肺纖維化(pulmonaryfibrosis,PF)是構(gòu)成ALI患者死亡的重要因素。因而針對(duì)ALI的炎癥失控及其繼發(fā)的肺纖維化采取“雙控調(diào)節(jié)”治療模式,可能成
2、為降低ALI死亡率的有效策略。炎癥小體(inflammasome)在炎癥研究領(lǐng)域備受關(guān)注,其活化后可促進(jìn)標(biāo)志性促炎因子IL-1β、IL-18和高遷移率族蛋白B1的成熟與分泌。近年來(lái),炎癥小體所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在ALI中的作用引起學(xué)者的關(guān)注,ALI時(shí)肺內(nèi)炎癥小體活化后的標(biāo)志性促炎因子IL-1β和IL-18表達(dá)顯著增加,提示ALI早期的“炎癥失控”可能與炎癥小體的表達(dá)上調(diào)和活化有關(guān)。ALI患者度過(guò)急性炎癥期后可繼發(fā)肺纖維化。ALI急性期伴隨大
3、量炎癥因子和促纖維化因子的合成與分泌,誘導(dǎo)肺內(nèi)成纖維細(xì)胞分化成熟為肌成纖維細(xì)胞,后者為肺纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞。此外肺內(nèi)上皮細(xì)胞(如肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞等)可通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)增加肺內(nèi)肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量。因此,尋找具有抗炎特性、調(diào)控成纖維細(xì)胞分化成熟和EMT的內(nèi)外源性保護(hù)因子可為ALI時(shí)繼發(fā)肺纖維化的治療提供新思路。ALI時(shí)肺內(nèi)脂質(zhì)代謝非?;钴S,其中花
4、生四烯酸(arachidonic acid,AA)可經(jīng)細(xì)胞色素P450(cytochromes P450,CYP)表氧化酶作用生成環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs),后者主要被可溶性環(huán)氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase,sEH)水解為活性極低的代謝產(chǎn)物DHET。EETs是細(xì)菌感染時(shí)肺內(nèi)主要的類(lèi)花生酸,具有降壓、減少心肌和腦組織的梗死面積和減輕吸煙引起的肺內(nèi)炎癥反
5、應(yīng)等效應(yīng)。但EETs對(duì)ALI是否具有保護(hù)作用,以及是否通過(guò)影響ALI時(shí)肺內(nèi)炎癥小體的活化而調(diào)控肺內(nèi)的炎癥反應(yīng)尚未見(jiàn)報(bào)道。Zhao等人報(bào)道EETs可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎上皮細(xì)胞α-SMA的表達(dá),上調(diào)E-鈣粘素的表達(dá),提示EETs可能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT。
目的:本研究擬探討AA-CYP-EETs代謝通路的重要活性物質(zhì)EETs在ALI及其繼發(fā)肺纖維化中的作用,并初步探討其機(jī)制。
方法:①采用連續(xù)3天腹腔注射低
6、劑量LPS(5 mg/kg)復(fù)制小鼠ALI模型,腹腔注射特異性可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑(TPPU,1 mg/kg/day)抑制小鼠體內(nèi)EETs的降解、增加體內(nèi)EETs含量,探討EETs對(duì)ALI的作用。觀察小鼠的一般情況;HE染色觀察小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變;BCA法測(cè)定小鼠BALF中總蛋白含量;采用相應(yīng)試劑盒分別檢測(cè)BALF中LDH活性和肺組織中MPO活性;采用RT-PCR法檢測(cè)主要炎癥小體蛋白NLRP3和NLRC4 mRNA的表達(dá);
7、ELISA法檢測(cè)小鼠BLAF中炎癥小體活化的標(biāo)志細(xì)胞因子IL-1β的含量;RT-PCR法檢測(cè)小鼠肺內(nèi)炎癥標(biāo)志因子TNF-α mRNA的含量。以小鼠巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察TPPU(1μM、10μM)對(duì)LPS(10μg/mL)應(yīng)激下小鼠巨噬細(xì)胞IL-1β的合成與分泌的影響,檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH活性。②復(fù)制小鼠ALI模型,并運(yùn)用TPPU抑制EETs的降解;Masson染色觀察小鼠肺組織中膠原沉積;檢測(cè)肺組織中脯氨酸含量;采用RT-PC
8、R法檢測(cè)小鼠肺內(nèi)TGF-β1、α-SMA和Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá);采用ELISA法檢測(cè)小鼠BALF和血清中TGF-β1的含量。以小鼠成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象,采用TGF-β1(5 ng/mL)誘導(dǎo)其分化為肺纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞肌成纖維細(xì)胞,應(yīng)用TPPU抑制EETs的降解,觀察EETs對(duì)成纖維細(xì)胞分化成熟的影響。RT-PCR法檢測(cè)肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志分子α-SMA的mRNA含量,消化法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸的含量。以人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞為研
9、究對(duì)象,采用TGF-β1(5 ng/mL)誘導(dǎo)其發(fā)生EMT,并應(yīng)用TPPU觀察EETs對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞EMT的影響。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,RT-PCR法檢測(cè)上皮標(biāo)志分子E-鈣粘素mRNA含量,消化法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸的含量。③構(gòu)建人重組CYP2J2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,通過(guò)雙酶切法和DNA測(cè)序驗(yàn)證插入序列的正確性。將人重組CYP2J2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人支氣管上皮細(xì)胞(HBECs)中,通過(guò)熒光顯微鏡觀察、RT-PCR法檢測(cè)其轉(zhuǎn)染
10、效率和效果。結(jié)合TPPU的運(yùn)用,采用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EETs對(duì)HBECs細(xì)胞增殖的影響,PI染色檢測(cè)細(xì)胞晚期凋亡,最后采用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察EETs對(duì)支氣管上皮損傷修復(fù)的影響。
結(jié)果:⑴與正常組小鼠比較,ALI組小鼠體重降低,肺內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫、肺泡隔增厚以及肺泡塌陷。TPPU處理可減輕上述改變。⑵與正常組相比,ALI組小鼠BALF中總蛋白含量和中性粒細(xì)胞數(shù)較正常組顯著增高(P<0.01);TPPU處理可降低總蛋白含
11、量和中性粒細(xì)胞數(shù),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。⑶與正常組相比,ALI組小鼠血清和BALF中LDH活性顯著升高,TPPU處理可顯著降低其活性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。⑷RT-PCR結(jié)果顯示,LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺內(nèi)主要炎癥小體蛋白NLRP3 mRNA和NLRC4 mRNA水平較正常組顯著升高(P<0.05)。⑸RT-PCR和ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,ALI小鼠肺內(nèi)IL-1β的mRNA表達(dá)水平和蛋白含量較正常組均顯著升高
12、,TPPU處理可顯著性抑制IL-1β的mRNA表達(dá)和蛋白含量,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。⑹RT-PCR結(jié)果顯示ALI組(0.28±0.03)小鼠肺內(nèi)TNF-α mRNA水平較正常組(0.60±0.09)顯著升高(P<0.05),TPPU處理可抑制ALI小鼠肺內(nèi)TNF-α mRNA的表達(dá)(0.45±0.05,P<0.05)。⑺LPS應(yīng)激可刺激小鼠巨噬細(xì)胞IL-1β蛋白的分泌,TPPU處理可降低LPS應(yīng)激的小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中
13、IL-1β的含量,差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。⑻LPS應(yīng)激可增加小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH活性,TPPU處理可顯著降低LDH的活性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。⑼Masson染色結(jié)果顯示,小鼠21天時(shí)肺內(nèi)大量膠原沉積,表明ALI/PF動(dòng)物模型復(fù)制成功。而TPPU處理可增加小鼠體重,減輕ALI組小鼠肺內(nèi)病理改變,減少膠原沉積。⑽正常組小鼠肺內(nèi)羥脯氨酸含量為0.47±0.06μg/g組織,ALI組小鼠肺內(nèi)羥脯氨酸含量顯著增
14、加(0.85±0.09μg/g組織),而TPPU處理可降低肺內(nèi)羥脯氨酸含量(0.63±0.09μg/g組織),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。⑾RT-PCR結(jié)果表明:與正常組相比,ALI組小鼠肺內(nèi)α-SMA、TGF-β1和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)顯著增加,TPPU處理可降低三者在ALI小鼠肺內(nèi)的表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。⑿與正常組相比,ALI組小鼠血清和BALF中TGF-β1含量顯著高。TPPU處理可降低其活性,差異具有
15、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。⒀TGF-β1(5 ng/mL)可顯著增加小鼠成纖維細(xì)胞α-SMA mRNA的表達(dá)和培養(yǎng)上清液羥脯氨酸的含量,TPPU預(yù)處理可明顯抑制α-SMA mRNA的表達(dá),以及降低培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸的含量,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。⒁TGF-β1誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞24 h后,可見(jiàn)細(xì)胞變長(zhǎng)并向兩端伸展,呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣改變;48h后改變更為明顯,TPPU預(yù)處理可顯著抑制上述形態(tài)改變。⒂與正常組相比,TGF-
16、β1可顯著性降低肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞E-鈣粘素mRNA的表達(dá),增加培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸的含量(P<0.05),TPPU預(yù)處理可明顯地促進(jìn)E-鈣粘素mRNA的表達(dá)、降低培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸的含量(P<0.05)。⒃成功構(gòu)建人重組CYP2J2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至HBECs中,通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察,轉(zhuǎn)染率為40%-60%。RT-PCR結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比,轉(zhuǎn)染人重組CYP2J2過(guò)表達(dá)質(zhì)??娠@著增加細(xì)胞內(nèi)CYP2J2 mRNA的表達(dá)(P<0
17、.05)。⒄MTT結(jié)果顯示,CYP2J2過(guò)表達(dá)可促進(jìn)HBECs細(xì)胞增殖;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,TPPU預(yù)處理可增加HBECs的G2/G1比值。⒅流式細(xì)胞術(shù)和PI染色結(jié)果表明LPS可誘導(dǎo)HBECs細(xì)胞凋亡(P<0.05),而TPPU預(yù)處理可顯著性抑制其凋亡(P<0.05)。⒆劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí),采用TPPU抑制HBECs的EETs的降解,增大修復(fù)指數(shù)(P<0.01),可促進(jìn)HBECs的損傷修復(fù)。
結(jié)論:①EETs減輕LPS誘導(dǎo)小鼠ALI
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