新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬檢測(cè)及雷帕霉素對(duì)預(yù)后的干預(yù).pdf

1、目的:研究新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)后海馬組織中神經(jīng)元細(xì)胞的損傷情況,通過(guò)觀察不同時(shí)間點(diǎn)及各組間細(xì)胞死亡、自噬相關(guān)蛋白的表達(dá),初步探討雷帕霉素對(duì)HIBD后神經(jīng)元存活的干預(yù)作用。
　　方法:采用7日齡新生SD(Sprague Dawley)大鼠,根據(jù)改良Rice-Vannucci法建立HIBD模型。將新生大鼠隨機(jī)分為雷帕霉素干預(yù)組(Ra組)、缺氧缺血組(HIBD組

2、)及假手術(shù)組(Sham組)。選取HIBD模型制成后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h及72h六個(gè)時(shí)間點(diǎn),通過(guò)Western blot法測(cè)定海馬組織中Cleaved caspase-3、Beclin-1、LC3蛋白濃度的變化;采用免疫組織化學(xué)法染色觀察海馬組織Cleaved caspase-3染色情況,結(jié)合HE染色及尼氏染色從細(xì)胞層面了解海馬區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生缺氧缺血損傷后的轉(zhuǎn)歸情況,并探討應(yīng)用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素對(duì)其發(fā)揮的干預(yù)作用

3、及可能機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1、HE染色結(jié)果:
　　1.1 Sham組腦組織海馬區(qū)域6個(gè)時(shí)間點(diǎn)HE染色后光鏡下觀察:海馬區(qū)域組織染色均勻、結(jié)構(gòu)清晰,神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常,胞質(zhì)染色為淡紅色,胞核染色為藍(lán)色;
　　1.2 HIBD組腦組織HE染色后光鏡下觀察:缺氧缺血側(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞變性及壞死的程度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而加重,表現(xiàn)為海馬區(qū)域組織結(jié)構(gòu)紊亂、間質(zhì)水腫,神經(jīng)細(xì)胞腫脹甚至壞死,胞核出現(xiàn)深染、固縮、碎裂,核仁消失,伴有不同

4、程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn);
　　1.3 Ra組腦組織HE染色后光鏡下觀察:缺氧缺血側(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)變性及部分神經(jīng)細(xì)胞壞死,但程度及范圍均較HIBD組輕;
　　2、Western-blot結(jié)果:
　　2.1 Beclin-1蛋白:與Sham組相比,HIBD組該蛋白自0h起表達(dá)迅速升高,至24h達(dá)高峰,且每個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均顯著高于Sham組(P<0.05);與HIBD組相比,Ra組該蛋白表達(dá)趨勢(shì)與HIBD組一致,且每個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)

5、均高于HIBD組,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);
　　2.2 LC3II:與Sham組相比,HIBD組及Ra組的該蛋白表達(dá)在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均高于Sham組,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);HIBD組及Ra組該蛋白均從0h起開(kāi)始上升,且Ra組的表達(dá)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于HIBD組,除外12h這一時(shí)間點(diǎn)外,其它5個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);
　　2.3 Cleaved caspase-3蛋白:與Sham組相比,H

6、IBD組及Ra組該蛋白的表達(dá)除0h無(wú)明顯增加外,其余5個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著升高,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與HIBD組相比,Ra組該蛋白表達(dá)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于HIBD組,但只有6h及12h具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);
　　3、Cleaved caspase-3蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果:
　　Sham組海馬區(qū)域各個(gè)時(shí)間點(diǎn)染色均較淺;與HIBD組相比,Ra組染色僅在6h及12h淺于HIBD組,且平均光密度值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

7、P<0.05),其余時(shí)間點(diǎn)兩組無(wú)顯著差異(P>0.05);
　　4、尼氏染色結(jié)果:
　　與Sham組相比,HIBD組及Ra組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均存在不同程度的海馬區(qū)域結(jié)構(gòu)紊亂、神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞核碎裂、溶解及尼氏小體崩解及丟失,隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重;根據(jù)尼氏染色計(jì)數(shù)神經(jīng)細(xì)胞丟失數(shù)目,與HIBD組相比,Ra組均少于HIBD組,隨時(shí)間延長(zhǎng)結(jié)果差異性越顯著,以48h及72h最明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);
　　結(jié)論: