骨髓基質(zhì)細(xì)胞及其上清液側(cè)腦室移植對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷海馬神經(jīng)元的作用.pdf

1、目的：探討缺氧缺血對新生大鼠海馬神經(jīng)元與學(xué)習(xí)記憶的影響，及骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）及其上清液移植后對其的治療作用。方法：取7日齡健康SD新生大鼠90只，其中10只取股骨骨髓，體外分離純化培養(yǎng)BMSCs，收集上清液，培養(yǎng)3代后用BrdU標(biāo)記BMSCs。剩余80只新生鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、細(xì)胞組和上清液組各20只。模型組新生鼠在無菌環(huán)境下結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，術(shù)后護(hù)理2小時(shí)后置于三氣培

2、養(yǎng)箱持續(xù)缺氧2h（氧濃度為8％，艙內(nèi)溫度（36±2）℃，濕度（70±5）％），制作新生鼠缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）模型，繼續(xù)母鼠喂養(yǎng)1w后（14日齡），新生鼠經(jīng)低溫麻醉，固定于腦立體定位儀下，酒精消毒后切開皮膚暴露顱骨，3％H2O2祛除骨膜，明確解剖位置，在腦立體定位系統(tǒng)的指示下選取左側(cè)腦室（坐標(biāo)AP：-0.5mm，ML：-2mm，DV：-2mm）為移植點(diǎn)，用微量進(jìn)樣器緩慢注

3、入2μl無菌0.01M的PBS液，術(shù)后縫合皮膚、消毒、25℃室溫下復(fù)蘇，母鼠喂養(yǎng)。細(xì)胞組用體外無菌培養(yǎng)的經(jīng)BrdU標(biāo)記的BMSCs（濃度為105/μl）代替0.01M的PBS液，其余同模型組。上清液組用經(jīng)冰凍干燥濃縮后的BMSCs上清液代替0.01M的PBS液，其余同模型組。假手術(shù)組僅暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈，但不結(jié)扎，并且不放入三氣培養(yǎng)箱缺氧，其余同模型組。各組大鼠在側(cè)腦室注射術(shù)后8周，進(jìn)行為期11 d的Morris水迷宮測試，記錄探查訓(xùn)練時(shí)

4、大鼠在目標(biāo)象限的搜索時(shí)間（T1）和對位探查訓(xùn)練時(shí)大鼠在目標(biāo)象限的搜索時(shí)間（T2）。水迷宮測試結(jié)束當(dāng)日，大鼠經(jīng)40g/L多聚甲醛灌注固定、取腦、石蠟包埋，經(jīng)海馬平面作冠狀切片（片厚5μm）。各例大鼠大腦切片分別做神經(jīng)元的特異性標(biāo)記--特異烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記--膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）和突觸素（Synapt

5、ophysin，SY）免疫組化染色，細(xì)胞組大鼠大腦切片并做BrdU免疫組化染色。各切片在400倍下用OLYMPUS Ax-70顯微成像系統(tǒng)對海馬拍照。IPP6.0軟件圖像分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：組間比較用方差分析，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。結(jié)果：Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示模型組大鼠T1和T2分別均較假手術(shù)組大鼠縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；細(xì)胞組和上清液組大鼠T1和T2分別均較模型組大鼠延長（P<0.05），但細(xì)胞組和上清液組大鼠T1和

6、T2比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。NSE和SY免疫組化結(jié)果顯示模型組大鼠海馬陽性細(xì)胞積分光密度（integral optical density，IOD）值均較假手術(shù)組IOD值減?。≒<0.05），細(xì)胞組和上清液組IOD值分別均較模型組增加（P<0.05），但細(xì)胞組和上清液組該兩指標(biāo)的IOD值之間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。GFAP免疫組化結(jié)果顯示模型組大鼠海馬陽性細(xì)胞IOD值較假手術(shù)組IOD值增加（P<0.05），

7、細(xì)胞組和上清液組IOD值均較模型組增加（P<0.05），但細(xì)胞組和上清液組IOD值之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。細(xì)胞組BrdU免疫組化結(jié)果未見陽性細(xì)胞。結(jié)論：1.結(jié)扎一側(cè)頸總動(dòng)脈，并經(jīng)一定時(shí)間（2h）、一定氧濃度（氧濃度8％）的缺氧可致新生大鼠海馬神經(jīng)元的損傷，并導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶降低，其機(jī)制與缺氧缺血對海馬神經(jīng)元的直接損傷有關(guān)。2.2μL BMSCs及上清液濃縮物側(cè)腦室注射可減輕缺氧缺血后神經(jīng)元的損傷，并可改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶