人胚胎卵巢miRNA表達(dá)譜及miR-376a調(diào)控原始卵泡形成的研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物中，卵巢原始卵泡庫的大小決定了雌性在整個(gè)生育周期中用于生殖的卵母細(xì)胞數(shù)。因此，原始卵泡庫的形成對(duì)于雌性哺乳動(dòng)物的生殖至關(guān)重要。在人類，這一過程的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致多種生殖疾病，如原發(fā)性卵巢功能不全和不孕。越來越多的研究表明，原始卵泡形成受到了嚴(yán)格的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。作為廣泛被研究的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，microRNA(miRNA)在不同的細(xì)胞生物學(xué)過程（包括生殖）中都發(fā)揮著重要作用。miRNA成熟過程所必需的核酸內(nèi)切酶Ⅲ——Dicer

2、的缺失，會(huì)導(dǎo)致雌性小鼠卵泡異常和不育。但是，在原始卵泡形成過程中，miRNA的生物學(xué)功能仍然知之甚少。組織特異性miRNA表達(dá)譜的建立，是我們研究已知和新的miRNA生物學(xué)功能的重要步驟。因此，我們利用Solexa深度測(cè)序技術(shù)，建立了正常人19～21周（原始卵泡形成活躍期）胚胎卵巢的miRNA表達(dá)譜，其中包括733條已知miRNAs和5條新miRNAs。在所有匹配到基因組的小RNA中，大部分的小RNA長(zhǎng)度介于19-23nt，其中，22n

3、t長(zhǎng)的小RNA所占比例最高，占所有小RNA的26.23％。我們對(duì)其中9條已知miRNAs的表達(dá)進(jìn)行了熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其結(jié)果與測(cè)序數(shù)據(jù)一致。通過對(duì)高豐度的和新的miRNAs預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行GO分析和KEGG信號(hào)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些靶基因，參與了細(xì)胞粘附分子(Cell adhesion molecules，CAMs)介導(dǎo)的信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號(hào)通路和Notch信號(hào)通路等，而這些信號(hào)通路已經(jīng)被證明在原始卵泡發(fā)生

4、過程中具有重要作用。這些發(fā)現(xiàn)為闡明miRNAs在卵泡發(fā)生中可能的調(diào)控作用，提供了基礎(chǔ)。
　　通過對(duì)正常人胚胎卵巢的miRNA表達(dá)譜研究，發(fā)現(xiàn)miR-376a可能調(diào)節(jié)增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，Pcna)。之前的研究顯示，Pcna通過調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞凋亡進(jìn)而影響小鼠原始卵泡形成，因此，對(duì)miR-376a和Pcna的調(diào)控進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-376a和Pcn

5、a mRNA在原始卵泡形成前后，表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)證明了miR-376a可以直接結(jié)合在Pcna mRNA的3'非編碼區(qū)(3'Untranslted Region，3'UTR)。在培養(yǎng)的18.5 dpc小鼠卵巢中，轉(zhuǎn)染miR-376a mimics可以抑制Pcna mRNA和蛋白的表達(dá)，卵母細(xì)胞凋亡受到抑制，存活的卵母細(xì)胞數(shù)目增多，進(jìn)而促進(jìn)了原始卵泡的形成。這也是第一對(duì)被證明在原始卵泡形成過程中具有調(diào)控功能的miRN