PPFP基因轉染對人正常甲狀腺細胞生物學特性的影響及蛋白質組學研究.pdf

1、中南大學博士學位論文PPFP基因轉染對人正常甲狀腺細胞生物學特性的影響及蛋白質組學研究姓名：劉劍鳴申請學位級別：博士專業(yè)：外科學指導教師：王志明20100501博上學位論文 中文摘要?？寺∧０錚 E G F P ．C 1 ．P P F P 中，利用P C R 方法調取目的基因P P F P ，將該基因克隆到慢病毒載體表達質粒p G C ．F U ( 含F l a g 基因) 中，得到重組的p G C ．F U ．P P F P ，通過P

2、 C R 、測序和分析比對驗證P P F P 基因后，將p G C ．F U —P P F P 質粒和包裝質粒p H e l p e r l ．0 、p H e l p e r 2 ．0 共同轉染人胚胎腎上皮細胞株2 9 3 T 細胞，獲得攜帶P P F P 基因的重組慢病毒，收集并濃縮病毒上清液，測定重組慢病毒的滴度。再以攜帶P P F P 基因的重組慢病毒感染目的細胞S V 4 0 大T 抗原永生化人正常甲狀腺細胞系N t h y

3、—o r i 3 ．1 ，觀察感染效率。選擇感染效率滿意的細胞通過R T —P C R 和W e s t e r n b l o t 多次檢測P P F P 的表達，以確定P P F P基因穩(wěn)定表達細胞株的建立。結果：( 1 ) P C R 方法成功獲得目的基因片段P A X 8 ．1 ．7 ，P A X 8 ．9及P P A I q ．1 ．6 ，并成功將P A X 8 和P P A I Ⅵ拼接，構建了P A X 8 與P P A R

4、 y 的融合基因的重組真核表達質粒p E G F P ．C l —P A X 8 ／P P A R y 。( 2 ) 以重組真核表達質粒p E G F P ．C 1 ．P A X 8 ／P P A R y 為模板，P C R方法成功獲得目的基因P P F P ，并成功構建P P F P 基因的重組慢病毒表達質粒p G C ．F U ．P P F P ，以該質粒與包裝質粒共轉染2 9 3 T 細胞，成功獲得攜帶P P F P 基因的高滴度

5、的重組慢病毒，病毒滴度達3 ．5x 1 07 T U ／m L 。( 3 ) 以攜帶P P F P 基因的重組慢病毒和空白慢病毒分別感染人正常甲狀腺細胞N t h v ．耐3 ．1 ，感染效率高，大于9 0 ％，以R T —P C R 和W e s t e r n b l o t 檢測證實P P F P 基因在m R N A 和蛋白水平順利表達，P P F P 基因穩(wěn)定表達細胞株成功建立，為進一步研究P P F P基因的功能及其作用機制

6、奠定了基礎。結論：( 1 ) 成功克隆了人P A X 8 與P P A R y 的融合基因( P P F P基因) ，并構建了P P F P 基因的重組慢病毒載體；( 2 ) 慢病毒載體是理想的基因轉移載體，可以高效的將P P F P 基因轉染至人正常甲狀腺細胞N t h y ．o r i 3 。1 ，轉染后P P F P 基因可持續(xù)穩(wěn)定表達。第二章P P F P 基因促進人正常甲狀腺細胞N t h y ．o r i3 一l 增殖和迂徙

7、運動能力的體外實驗研究目的：探討P P F P 基因轉染對人正常甲狀腺細胞N t h y ．o r i 3 ．1 生物學特性的影響，以明確P P F P 基因在F T C 發(fā)生發(fā)展過程中的作用。方法：以P P F P 基因穩(wěn)定表達細胞株N t h y ．o r i3 ．1 P P F P 、空白慢病毒感染細胞株N t h y ．o r i 3 ．1v e c 附以及未感染細胞株N t h y ．o r i3 ．1 為研究對象，通過M T