MicroRNA-7基因敲減對(duì)小鼠胸腺細(xì)胞發(fā)育的影響.pdf

1、本研究包括三部分內(nèi)容，分述如下：
　　目的：
　　第一部分鑒定miR-7基因敲減小鼠模型，為進(jìn)一步深入研究miR-7的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分研究miR-7基因敲減對(duì)小鼠胸腺細(xì)胞發(fā)育的影響。
　　第三部分探討miR-7基因敲減影響小鼠胸腺細(xì)胞發(fā)育的機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分
　　1.常規(guī)剪取7只miR-7基因敲減(miR-7 knock down，miR-7KD)小鼠的腳趾和尾巴

2、，按照DNA試劑盒說明書以及Trizol法分別提取其基因組DNA和總RNA。剪取1只WT(wild-type，WT)小鼠的尾巴，Trizol法提取其總RNA，并將其作為陰性對(duì)照。將提取的兩組小鼠的總RNA分別逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后，以基因組DNA和cDNA為模板，利用miR-7-sponge真核表達(dá)載體特異性引物，采取PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因片段—增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，E

3、GFP)。
　　2.提取WT和miR-7KD小鼠的心臟、肝臟以及脾臟等7個(gè)不同組織器官的總RNA，用miR-7特異性引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用Real-time PCR探針法檢測(cè)各組織器官中miR-7成熟體的表達(dá)水平。
　　3.觀測(cè)并記錄兩組小鼠從2周到12周以內(nèi)的體重變化以及從出生到24周以內(nèi)的總生存率。
　　4. HE染色觀察第13周的miR-7KD小鼠心臟、肺臟、肝臟以及腎臟的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)改變。
　　第二部分

4、
　　1.檢測(cè)miR-7KD小鼠較WT小鼠胸腺大小、重量以及細(xì)胞總數(shù)的變化。
　　2.利用原位雜交技術(shù)以及 Real-time技術(shù)檢測(cè)miR-7KD小鼠胸腺miR-7的表達(dá)水平。
　　3. HE染色觀察miR-7KD小鼠胸腺的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)改變。
　　4.采用流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)胸腺T細(xì)胞各亞群的比例變化；并進(jìn)一步檢測(cè)其細(xì)胞活化分子CD44、CD62L以及CD69的比例。
　　

5、5.利用核抗原Ki67染色法和PI法檢測(cè)胸腺各細(xì)胞亞群的增殖以及凋亡比例。
　　6. TCR特異性信號(hào)以及PMA和離子霉素體外誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞，觀察細(xì)胞增殖的變化。
　　7.通過FCM檢測(cè)miR-7KD小鼠胸腺各細(xì)胞亞群中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17以及RORγt的比例變化。
　　第三部分
　　1.常規(guī)提取小鼠胸腺單細(xì)胞懸液，Trizol法提取其RNA，送上?？党缮锕具M(jìn)行NimbleGen Gene

6、Expression Profile檢測(cè)。然后，根據(jù)基因表達(dá)譜芯片結(jié)果，我們進(jìn)行差異基因GO（Gene Ontology）分析和與T細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路分析。GO分析包括三個(gè)方面：生物過程（Biological Process），細(xì)胞組成（Cellular Component）和功能分子（Molecular Function）。信號(hào)通路分析主要分析與T細(xì)胞增殖活性相關(guān)信號(hào)通路的關(guān)鍵分子在RNA表達(dá)水平上的差異。
　　2.依據(jù)基因表

7、達(dá)譜芯片結(jié)果，通過靶基因預(yù)測(cè)軟件并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道預(yù)測(cè)miR-7在胸腺細(xì)胞中的潛在靶標(biāo)。
　　3. Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)潛在靶基因的表達(dá)水平。
　　4. Western Blot技術(shù)檢測(cè)胸腺蛋白中總ERK1/2和磷酸化-ERK1/2表達(dá)的改變。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1. PCR結(jié)果顯示，除WT小鼠外，模型小鼠的腳趾基因組DNA以及鼠尾cDNA中均能擴(kuò)增出目的基因片段-EGFP。

8、>　　2. Real-time PCR結(jié)果顯示，miR-7KD小鼠心臟、肝臟以及脾臟等7個(gè)重要組織器官中miR-7成熟體的表達(dá)水平較WT小鼠均顯著下調(diào)（P<0.05）。
　　3.從第2周到第12周內(nèi)，miR-7KD小鼠較WT小鼠體重顯著降低，體積明顯減小，且24周內(nèi)死亡率明顯增加（P<0.05）。
　　4. HE染色結(jié)果顯示，miR-7KD小鼠心臟、肺臟、肝臟以及腎臟形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的病理性改變。
　　第二部分

9、r>　　1.與 WT小鼠相比，miR-7KD小鼠胸腺大小、重量以及細(xì)胞總數(shù)均顯著減少（P<0.05）。
　　2.原位雜交與RT-PCR結(jié)果顯示，miR-7KD小鼠較WT小鼠胸腺中miR-7成熟體的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。
　　3. HE染色結(jié)果顯示miR-7KD小鼠胸腺形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的病理性改變。
　　4. FCM結(jié)果顯示，miR-7KD小鼠胸腺 CD4+單陽性細(xì)胞（CD4+ single positi

10、ve，CD4+SP）以及 CD8+單陽性細(xì)胞(CD8+ single positive，CD8+SP）比例明顯降低（P<0.05），然而CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞（CD4+CD8+double positive，CD4+CD8+DP）比例無顯著改變。進(jìn)一步的FCM結(jié)果顯示，與 WT小鼠相比，miR-7KD小鼠胸腺CD4+SP以及 CD8+SP細(xì)胞中 CD44、CD62L以及 CD69陽性比例均顯著增加（P<0.05），且其Ki67以及P

11、I的陽性率也明顯上調(diào)（P<0.05）。
　　5. Anti-CD3/CD28協(xié)同刺激胸腺細(xì)胞，并于24h、48h以及72h時(shí)分別觀察細(xì)胞增殖變化，結(jié)果顯示miR-7KD小鼠較WT小鼠胸腺細(xì)胞增殖能力均明顯下調(diào)（P<0.05）。同樣，PMA與離子霉素體外共刺激胸腺細(xì)胞6h后的增殖結(jié)果顯示與anti-CD3/CD28刺激結(jié)果是一致的。
　　6. FCM結(jié)果顯示，miR-7KD小鼠胸腺中 CD4+SP以及 CD8+SP細(xì)胞中細(xì)胞因

12、子IFN-γ、IL-4、IL-17以及RORγt的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.05）。
　　第三部分
　　1.基因芯片結(jié)果顯示，WT小鼠與miR-7KD小鼠的胸腺細(xì)胞中存在許多基因表達(dá)差異。并且，其中一些與T細(xì)胞增殖活性相關(guān)的信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)在RNA水平上也存在顯著差異性。
　　2.推測(cè)出Smad5與Snap23為miR-7在胸腺細(xì)胞中潛在作用靶標(biāo)。
　　3. RT-PCR結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，miR-7

13、KD小鼠胸腺細(xì)胞中Smad5以及Snap23的表達(dá)水平明顯增加（P<0.05）。
　　4. miR-7KD小鼠胸腺中總 ERK1/2以及磷酸化-ERK1/2的表達(dá)水平均明顯下調(diào)（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　第一部分
　　1.我們成功鑒定了miR-7基因敲減小鼠模型。
　　2. miR-7敲減后，小鼠生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，死亡率增加，且多個(gè)重要組織器官發(fā)生病理學(xué)改變。
　　第二部分
　　1. miR