綿羊Flt-1基因的克隆及在妊娠期生殖器官中表達(dá)水平的研究.pdf

1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有促增殖的作用，是與細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化有關(guān)的重要生長(zhǎng)因子。在雌性哺乳動(dòng)物的生殖過(guò)程，包括早期胚胎發(fā)育，胚胎著床及子宮蛻膜化妊娠的維持及分娩等過(guò)程中，VEGF都起著十分重要的作用。但 VEGF 必須與其相應(yīng)受體(VascularEndothelial Growth Factor Receptor，VEGFR)相結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)

2、活性。VEGF受體在表達(dá)定位已有許多學(xué)者在禽、豬、人等動(dòng)物上作過(guò)大量研究工作，但在妊娠綿羊上尚未作研究。因此本文以繁殖力高低不同的兩個(gè)綿羊品種為研究對(duì)象，研究血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體——Flt-1基因在其妊娠期生殖器官表達(dá)變化水平，以期為對(duì)哺乳動(dòng)物胚胎的體外發(fā)育、胚胎移植和雌性哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)疾病的治療提供參考依據(jù)。 本文以妊娠期東北細(xì)毛羊和小尾寒羊成年母羊的雌性生殖器官——子宮、輸卵管和卵巢為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)VEGF受體Fit-1

3、基因(the fms-like tyrosine kinase，F(xiàn)it-1)cDNA文庫(kù)構(gòu)建、T-A克隆技術(shù)，將Fit-1基因cDNA PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pMD19-T-Vector中，轉(zhuǎn)化至受體菌JM109中，通過(guò)質(zhì)粒提取、PCR、序列測(cè)定等方法鑒定構(gòu)建出重組陽(yáng)性克隆質(zhì)粒pMD19-T-VEGFR1。同時(shí)以β-Actin作為內(nèi)源性?xún)?nèi)標(biāo)，采用了反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RLT-PCR)方法檢測(cè)了Flt-1mRNA在東北細(xì)毛羊和小尾寒羊

4、的不同的妊娠時(shí)期子宮、輸卵管和卵巢中的表達(dá)規(guī)律。 研究結(jié)果表明：(1)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)，從綿羊子宮角的總RNA中擴(kuò)增了82bp的Flt-1的部分基因。經(jīng)DNAsis軟件分析核苷酸序列，結(jié)果顯示該實(shí)驗(yàn)株與NCBI報(bào)道的同源性達(dá)到98.9％。 (2)在相同的妊娠期間里，東北細(xì)毛羊和小尾寒羊成年母羊雌性生殖器官中Flt-1 基因有相同的表達(dá)趨勢(shì)，各期的子宮內(nèi)膜上Fit-1mRNA都強(qiáng)烈表達(dá)，在輸卵管和

5、卵泡上可見(jiàn)有少量的表達(dá)，F(xiàn)it-1mRNA的表達(dá)的強(qiáng)度為：子宮>輸卵管>卵泡，各組間差異顯著(p<0.05)。 (3)綿羊在不同妊娠期間子宮內(nèi)膜中Fit-1的mRNA強(qiáng)烈表達(dá)，且妊娠早期<妊娠中期<妊娠晚期，F(xiàn)lt-1的mRNA表達(dá)量有逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)。各組間差異顯著(p<0.05)。 (4)在相同的妊娠時(shí)期，小尾寒羊妊娠母羊子宮內(nèi)膜中的Fit-1 mRNA的表達(dá)量高于東北細(xì)毛羊妊娠母羊，且前者Flt-1mRNA的表達(dá)量相