雞的性比及性分化早期胚胎性別差異表達(dá)基因研究.pdf

1、雞的性別控制在現(xiàn)代養(yǎng)雞生產(chǎn)中具有重要意義,然而目前仍沒有較好的方法實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。現(xiàn)有的性別控制方法有通過影響控制雞性比的因素使性比偏向生產(chǎn)所需及通過干擾雞的性腺分化產(chǎn)生性反轉(zhuǎn)雞等,本研究圍繞這兩個(gè)主題,一方面利用早期雞胚性別鑒定方法全面分析正常生產(chǎn)條件下雞的各種性比及產(chǎn)生性比偏向的可能因?yàn)?；另一方面利用抑制消減雜交(SSH)技術(shù)分離性分化早期雌、雄雞胚性腺的差異表達(dá)基因,并對(duì)這些基因進(jìn)行進(jìn)一步研究,為探討性別決定與性分化的分子機(jī)理奠定基

2、礎(chǔ)。具體研究如下:
　　 組合擴(kuò)增W染色體上360 bp的EE0.6特異片段和Z染色體上970 bp的OVR基因片段的兩對(duì)引物,應(yīng)用雙重PCR技術(shù)建立了雞性別鑒定分子方法,經(jīng)驗(yàn)證其準(zhǔn)確率達(dá)100％；利用該方法成功判定了早期雞胚的性別,其中早期死亡雞胚的性別判出率達(dá)92.34％。結(jié)合分子鑒定雞胚性別及剖檢鑒定性別的方法分析了人工飼養(yǎng)條件下140只母雞在30天內(nèi)的子代性比,結(jié)果表明“所有母雞”組和“高繁殖力母雞”組(76只)的出殼雛

3、雞和總體子女(包括孵化過程中的死胚)的性比均不顯著偏離理論性比值1:1,但孵化過程中死亡的雌性胚胎數(shù)量顯著超過雄性(P＜0.05)；高繁殖力母雞中,大部分個(gè)體的親本性比不同程度地偏離理論性比,其中有7只(占9.21.％)子代性比顯著偏離理論值(P＜0.05),另有37只產(chǎn)生至少連續(xù)4個(gè)為同一性別的種蛋。
　　 以孵化3.5-6天的雞胚性腺組織為材料,應(yīng)用SSH技術(shù)構(gòu)建了性分化早期雌、雄雞胚間正反向消減cDNA文庫(kù),以持家基因GA

4、PDH為參照指標(biāo)檢測(cè)消減文庫(kù)的消減效率,結(jié)果表明兩個(gè)文庫(kù)的消減效率均高達(dá)25倍。從每個(gè)文庫(kù)中隨機(jī)挑選96個(gè)克隆進(jìn)行PCR鑒定,發(fā)現(xiàn)cDNA插入片段的長(zhǎng)度主要分布于250-750 bp之間,F-M(以雌性雞胚為tester、雄性雞胚為driver)和M-F(以雄性雞胚為tester、雌性雞胚為driver)消減cDNA文庫(kù)中有效陽(yáng)性克隆率分別達(dá)93.8％和90.6％。利用斑點(diǎn)雜交技術(shù),以正向消減cDNA和反向未消減cDNA作為探針對(duì)F-M

5、文庫(kù)中1200個(gè)克隆和M-F文庫(kù)中900個(gè)克隆進(jìn)行篩選,結(jié)果表明兩個(gè)文庫(kù)中差異明顯(相差至少3倍以上)的陽(yáng)性克隆率分別為31％和26％。將已測(cè)序的152個(gè)差異表達(dá)克隆的cDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明F-M文庫(kù)的86個(gè)克隆代表了41個(gè)基因,其中39個(gè)為已鑒定基因、2個(gè)具有同源EST序列；M-F文庫(kù)的66個(gè)克隆代表了47個(gè)基因,其中16個(gè)為已鑒定基因,12個(gè)有EST同源序列,25個(gè)沒有任何同源序列。根據(jù)哺乳動(dòng)物中同源基因的

6、功能推測(cè)41個(gè)已知功能的差異表達(dá)基因(F-M中31個(gè),M-F中10個(gè))分屬于DNA水平相關(guān)因子、RNA水平相關(guān)因子、結(jié)構(gòu)蛋白、酶類、癌癥相關(guān)基因及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子等。分析88個(gè)差異表達(dá)基因在雞基因組中的分布,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因主要分布于雞1-5號(hào)染色體上,其中F-M文庫(kù)中有1個(gè)基因位于W染色體上,F-M文庫(kù)和M-F文庫(kù)中分別有2個(gè)和3個(gè)基因位于Z染色體上。將差異表達(dá)cDNA.片段在GenBank的雞EST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明分別有80.

7、49％和34.04％的雌、雄性差異表達(dá)基因在兩個(gè)已報(bào)道雞胚性腺相關(guān)文庫(kù)(gonad cDNA library and gPGC cDNA library)中有同源序列；通過比較cDNA片段在消減文庫(kù)及兩個(gè)已報(bào)道性腺相關(guān)文庫(kù)中的重復(fù)率,初步分析了這些基因在雞胚性腺中的基本表達(dá)特征。
　　 用RT-PCR方法分析了7個(gè)功能候選基因及46個(gè)新發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)基因(F-M文庫(kù)34個(gè),M-F文庫(kù)12個(gè))在雞胚早期性腺發(fā)育過程中(第4-12天

8、)的表達(dá)譜,結(jié)果表明:功能候選基因中除cEki2和cFog2在兩性中表達(dá)水平相似外,cBrd3、cVnn1、cPpt1、cLhx9和cGATA4五個(gè)基因在雞性腺分化過程中呈兩性差異性表達(dá)；另外從表達(dá)模式上看,除cVnn1的表達(dá)模式及cGATA4/cFog2的相互作用模式與哺乳動(dòng)物相似外其它都不相同；新發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)基因大部分(F-M,85.29％；M-F,91.67％)為真實(shí)差異表達(dá),相對(duì)表達(dá)水平相差達(dá)2倍以上的基因在F-M、M-F文庫(kù)

9、中分別有13個(gè)和6個(gè),其中于性分化前期(第4-5天)兩性中表達(dá)差異明顯的分別有10個(gè)和1個(gè)；而表達(dá)差異小于2倍的基因在F-M、M-F文庫(kù)中分別有16及5個(gè)。此外,還通過WISH定位分析基因表達(dá)的方法初步分析了SMARCE1在5.5天和8.5天雞胚泌尿生殖系統(tǒng)的表達(dá),結(jié)果表明該基因在5.5天兩性雞胚的泌尿生殖系統(tǒng)中均有表達(dá)且表達(dá)量基本相同,在性腺形態(tài)已分化的8.5天雄性雞胚的性腺和腎臟外側(cè)呈明顯陽(yáng)性表達(dá)。
　　 應(yīng)用SMART技術(shù)

10、成功克隆了HMG-14A基因的一個(gè)新轉(zhuǎn)錄本(F071)和Z染色體上一個(gè)非編碼RNA(A041)的全長(zhǎng)cDNA序列,GenBank登錄號(hào)分別為EF422210、EF422212。F071基因全長(zhǎng)cDNA序列為1026 bp,ORF Finder預(yù)測(cè)其最大開放閱讀框?yàn)?18 bp,編碼105個(gè)氨基酸；該基因的核苷酸和氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明F071與雞HMG-14A基因(NM_001079480.1)的同源性最高,兩者核苷酸同源區(qū)段覆蓋率為8

11、5％,但兩者所編碼的氨基酸相似性為100％。用Signal P3.0、ProtParam、Prosite等軟件對(duì)基因所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能等特征進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析,結(jié)果表明F071蛋白為富含賴氨酸的非分泌性蛋白,它含有HMG14和HMG17信號(hào)、一個(gè)依賴于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、一個(gè)酰胺化位點(diǎn)、一個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、兩個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)；根據(jù)CLUSTALW結(jié)果,用MEGA3.1軟件構(gòu)建了HM