外周血Treg細胞及NKG2D+NK細胞表達在結直腸癌患者中的臨床意義.pdf

1、研究背景:
　　研究統計，近年來結直腸癌(colorectal cancer，CRC)一直是世界范圍內發(fā)病率和致死率位居前三的惡性腫瘤之一，每年全球都有數百萬新發(fā)病例及約600，000人死于結直腸癌。隨著飲食習慣和飲食結構的改變，我國結直腸癌發(fā)病率和死亡率也呈上升趨勢。由于結直腸癌早期臨床癥狀不明顯，大多數患者確診時已屬中晚期。目前結直腸癌的發(fā)生發(fā)展及免疫逃逸機理仍不明確，對于喪失手術時機的結直腸癌患者仍缺乏更有效的治療方法。因此

2、，尋找理想的結直腸癌早期診斷和預后評價指標以及理想的治療靶點十分必要。
　　自然殺傷(Natural killer，NK)細胞是機體重要的先天免疫效應細胞，能清除體內的腫瘤細胞、被病毒或細菌感染的細胞等，發(fā)揮天然免疫監(jiān)視功能。NK細胞表面存在多種活化性和抑制性受體，其細胞毒作用的發(fā)揮就依賴于各種活化和抑制信號的綜合。NKG2A(Natural-killer group 2，member A)是NK細胞表面的一種重要的抑制性受體，特

3、異性識別和結合其配體HLA-E，向NK細胞傳遞抑制信號。NKG2D(Natural-killer group 2，member D)是NK細胞表面的一種主要的活化性受體，特異性識別和結合其配體MICA/B、ULBPs后，向NK細胞傳遞活化信號。多項研究表明，NKG2D介導的NK細胞毒作用下降可能是造成腫瘤細胞免疫逃逸的原因之一。
　　調節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Tregs)是機體重要的免疫抑制性細胞，可抑制

4、CD8+CTL細胞、NK細胞及樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)等多種免疫效應細胞的功能，是腫瘤免疫逃逸的關鍵因素。目前天然CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞是研究最為深入的一類Treg細胞。叉頭轉錄因子(Fork head box protein 3，Foxp3)是Treg細胞最關鍵的細胞內標志物，對于Treg細胞的分化和功能維持具有重要作用。研究發(fā)現Treg細胞在結直腸癌、肝癌、卵巢癌及前列腺癌等患者外周血

5、和腫瘤局部微環(huán)境中比例增高，且Treg細胞水平與患者腫瘤進展及預后呈負相關;在腫瘤切除后Treg細胞恢復到正常水平，而腫瘤復發(fā)時Treg細胞增多。
　　研究報道，Treg細胞可以通過細胞接觸依賴機制(cell-contact-dependantmechanism)及分泌轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)β、IL-10等免疫抑制性細胞因子抑制NK細胞的活化，從而使腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視。然而，

6、Treg細胞與NK細胞受體NKG2A、NKG2D在結直腸癌中的表達、相互關系及臨床意義尚不明了。
　　基于上述研究現狀，為了深入認識Treg細胞、NK細胞及其受體NKG2A與NKG2D表達在結直腸癌患者中的臨床意義，以便為結直腸癌的診斷和治療提供新的思路和實驗依據，本研究確定研究目的及研究方法如下。
　　研究目的:
　　1.觀察CRC患者外周血中NK細胞抑制性受體NKG2A及活化性受體NKG2D在mRNA水平及蛋白水平

7、的表達情況。
　　2.觀察封閉純化NK細胞受體NKG2D表達對NK細胞毒作用及脫顆粒作用的影響。
　　3.觀察CRC患者外周血中Treg細胞水平及其與淋巴結轉移、臨床分期的關系。
　　4.平行測定CRC患者外周血中Treg細胞水平、NKG2D+NK細胞水平及血清癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)水平，評價它們的相關性。
　　研究方法:
　　1.患者與對照CRC患者97例（

8、男52例，女45例）收自山東省立醫(yī)院胃腸外科。所有患者的確診根據衛(wèi)生部頒布的結直腸癌診斷標準(2010)，并排除合并糖尿病、腎病、肝病或其它自身免疫性疾病，標本收集前均未接受放、化療。健康對照48例（男26例，女22例）收自山東省立醫(yī)院健康查體中心。本課題得到山東大學附屬山東省立醫(yī)院倫理委員會的批準。
　　2.細胞與細胞培養(yǎng)抽取研究個體15mL抗凝靜脈血，用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(perip

9、heral blood mononuclear cells，PBMCs)。采用免疫磁珠方法陰性分選NK細胞，流式細胞術測定CD3-CDC6+NK細胞純度達95％。獲得的NK細胞在含10％滅活胎牛血清(fetal calf serum，FCS)、1％青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入100U/mL重組人白介素(recombinant human interkin，rIL)2，在37℃及5％CO2孵箱中孵育。
　　人結腸癌細

10、胞株HT29作為靶細胞，在含10％滅活FCS、1％青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37℃及5％CO2孵箱中孵育。2-3天更換1次培養(yǎng)基，細胞在使用前洗2次。
　　在抗體封閉試驗中，NK細胞先與不同濃度抗NKG2D中和抗體孵育30min，然后與靶細胞HT29共同孵育，之后進行細胞毒試驗及CD107a脫顆粒試驗。
　　3.實時定量PCR總RNA根據廠家說明書用TRIzol試劑從PBMCs中提取。提取的總RNA的濃度和質

11、量由測定的吸光度A260及A260/A280比率評價。反轉錄體系(20μL)包括:1μ總RNA，2μL的Maxima enzyme mix，4μL的5×PCRmix。反轉錄程序如下:25℃10min，55℃30min，85℃5min。獲得的cDNA在用于PCR擴增前作10倍稀釋。
　　引物包括:CD94，NKG2A，NKG2D及β-actin。PCR反應體系(20μL)包括:5μL的cDNA，5μL的0.8μM上下游引物，10μL

12、的2×PCRmix。擴增程序如下:95℃5min，然后45個循環(huán):95℃15sec，60℃30see，72℃15sec。用96孔板在羅氏Light Cycler480序列測定系統上合成PCR產物。最后，將PCR產物電泳以評價是否合成了要求的產物。
　　4.流式細胞術NKG2A和NKG2D檢測屬于表面抗原檢測，用10μL抗人CD3抗體，5μL抗人CD56抗體，10μL抗人NKG2A抗體，10μL抗人NKG2D抗體對PBMCs染色，同

13、時使用同型對照。
　　Treg細胞用調節(jié)性T細胞試劑盒參照廠家說明書測定。對于表面抗原染色，在100μL全血中加入10μL抗人CD4抗體和10μL抗人CD25抗體，4℃避光孵育30min。然后室溫加入1×RBCLysisBuffer溶解紅細胞。對于細胞內抗原染色，需要先破壞細胞膜，在細胞中加入fixation/permeabilization working solution，避光孵育60min。然后加入10μL抗人Foxp3抗體

14、染色。同時使用同型對照抗體。
　　對于CD107a脫顆粒測定，將NK細胞與HT29在37℃混合培養(yǎng)，培養(yǎng)體積為200μL，然后每孔加入10μL抗人CD107a抗體。37℃孵育1h后，加入1.7μL莫能霉素(0.1mg/mL)，再孵育3h。同時設對照孔。收集細胞后，再加入10μL抗人CD3抗體及5μL抗人CD56抗體進行表面抗原染色。
　　用EPICSXL流式細胞儀(Beckman Coulter)或BDFACSⅡ流式細胞儀(

15、BD Biosciences)至少計數10，000個細胞。
　　5.細胞毒測定采用51Cr釋放試驗，純化NK細胞作為效應細胞，HT29作為靶細胞。HT29與51Cr同位素在37℃孵育1h。被標記的靶細胞與NK細胞以不同效靶比共孵育4h。收集上清，用γ-counter(Packard CobraⅡ5002)分析。計算51Cr釋放百分率。自發(fā)性釋放應小于最大釋放的15％。
　　6.血清CEA測定非特異性腫瘤標志物CEA作為CRC

16、患者的診斷、療效監(jiān)測和預后判斷指標，在我院生化室采用羅氏Cobase601系統檢測。在健康人群中，CEA的參考范圍是0-10ng/L。
　　7.統計學分析采用Graph Pad Prism軟件對數據進行統計學分析。ttest用于比較2個組之間的可數變量結果。one-way Anova用于比較3或4組之間的可數變量。Spearman correlation analysis用于判斷2個變量之間的相關性。p＜0.05被認為具有統計學意

17、義。
　　結果:
　　1.CRC患者外周血NKG2A在mRNA水平、蛋白水平及NK細胞表面的表達水平均與健康對照相似;而NKG2D在mRNA水平、蛋白水平及NK細胞表面的表達水平均顯著低于健康對照。
　　2.用抗NKG2D中和抗體封閉NKG2D路徑后，NK細胞毒作用及CD107a脫顆粒均隨著抗NKG2D中和抗體濃度的增加而降低。
　　3.NKG2A和NKG2D也可以在NKT細胞及T細胞上表達。但NKG2A在外周血

18、NK細胞、NKT細胞及T細胞上的表達依次降低;NKG2D在外周血T細胞上的表達顯著低于NK細胞和NKT細胞。
　　4.CRC患者外周血CD4+CD25+Foxp3+及CD4+CD25highFoxp3+Treg細胞均比健康對照顯著升高，但與淋巴結轉移、臨床分期不相關。
　　5.在CRC患者和健康對照外周血中，CD4+CD25highFoxp3+細胞水平均顯著高于CD4+CD25lowFoxp3+細胞水平。
　　6.CR

19、C患者上調的CD4+CD25+Foxp3+及CD4+CD25highFoxp3+Treg細胞水平與下調的NKG2D+NK細胞水平無統計學相關性。
　　7.CRC患者CD4+CD25+Foxp3+及CD4+CD25highFoxp3+Treg細胞水平與血清CEA水平之間未發(fā)現統計學相關性，盡管一些嚴重的進展期CRC患者Treg細胞和血清CEA同時增高。
　　結論:
　　結直腸癌患者抑制性受體NKG2A和活化性受體NKG2

20、D在轉錄水平及翻譯水平的表達失衡，可能與NK細胞活性抑制相關。我們推論CRC腫瘤細胞可以經由NKG2路徑逃避NK細胞免疫監(jiān)視;然而，其潛在的機制需要進一步探究。CRC患者外周血免疫抑制性Treg細胞表達顯著增高，而外周血NKG2D+NK細胞表達顯著降低，但均與CRC患者是否合并淋巴結轉移及臨床分期不相關。受到研究樣本量的限制，在上調的Treg細胞與下調的NKG2D+NK細胞之間我們未發(fā)現顯著的統計學相關性;在Treg細胞與血清CEA水平