毛竹細胞骨架微管蛋白基因PeTua3和PeTub3研究.pdf

1、竹林是我國重要的森林資源，竹材是由各種類型細胞的細胞壁及其包圍的空間所組成的復雜生物材料，因其具有強度高、韌性好、硬度大等特點而在建筑、造紙等領(lǐng)域得到廣泛的利用。竹子優(yōu)良的材性特點與其細胞壁的組成及結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，竹子細胞壁的發(fā)育對竹子的生長發(fā)育、生理特性、生化代謝以及對外界環(huán)境脅迫的有機反應發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，對竹子材性的形成起著決定性作用。細胞骨架指導細胞壁的生物合成，作為細胞骨架的重要組成部分，微管蛋白在細胞壁發(fā)育過程中起著重要的

2、調(diào)控作用。本研究以我國重要經(jīng)濟竹種--毛竹（Phyllostachys edulis）為材料，分離細胞骨架微管蛋白基因，在對其序列進行充分分析的基礎上，通過體外表達和在模式植物中的表達來驗證其功能，以其為通過基因工程手段培育竹類植物新品種奠定基礎。主要研究結(jié)果如下：
　　1、采用RT-PCR方法從毛竹葉片中克隆了2個微管蛋白基因，分別命名為PeTua3和PeTub3。PeTua3的編碼區(qū)為1353 bp，編碼451個氨基酸；PeT

3、ub3的編碼區(qū)1341 bp，編碼447個氨基酸。
　　2、Blast分析表明PeTua3和PeTub3與已報道的其它植物的tubulin蛋白具有很高的相似性，分別屬于 tubulin蛋白的Tua3和 Tub3家族，都是疏水性酸性蛋白。通過MOTIFSCAN軟件預測蛋白質(zhì)的功能性位點，結(jié)果顯示PeTua3和PeTub3序列均包含有N-糖基化位點、磷酸化酪蛋白激酶 II位點、N-肉豆蔻?；稽c和磷酸化蛋白激酶位點、GTP酶域和C末端

4、結(jié)構(gòu)域，但是這些位點在蛋白序列中的位置、數(shù)量均存在一定的差異，這意味著它們可能存在功能上的不同。應用MEGA4.0軟件，構(gòu)建基于tubulin蛋白的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明：PeTua3與水稻的Tua3蛋白在進化關(guān)系上最近，Petub3與牛筋草的Tub3蛋白在進化關(guān)系上最近，而與大部分雙子葉植物Tubulin蛋白的關(guān)系較遠，這與毛竹屬于單子植物禾本科竹亞科的形態(tài)學分類相吻合。
　　3、通過構(gòu)建PeTua3和PeTub3基因的原核表達載

5、體pET-32b-PeTua3和pET-30a-PeTub3，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)菌株DE3，進行基因的體外表達研究。經(jīng)過優(yōu)化誘導表達條件，在37℃，0.4 mmol·L-1 IPTG誘導2 h的條件下獲得高豐度的PeTua3可溶性重組蛋白；在28℃，0.4 mmol·L-1 IPTG誘導4 h的條件下獲得高豐度的PeTub3可溶性重組蛋白。應用His標簽親和純化方法，獲得PeTua3、PeTub3的重組

6、蛋白，并處理擬南芥種子，幼苗表現(xiàn)為上胚軸明顯增粗，側(cè)根增多，這意味著重組蛋白可能具有加快細胞的分裂的生物學活性。
　　4、構(gòu)建PeTua3和PeTub3基因的正義和反義植物表達載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥，通過抗性篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株。表型觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥（正義和反義）和野生擬南芥在發(fā)芽和莖的生長上沒有因基因的過量表達或抑制而受到影響，但對根系生長影響明顯。PeTua3和 PeTub3基因的過量表達均促進擬南芥根系生長，側(cè)根增多；石蠟切

7、片顯示根系表皮薄壁細胞數(shù)量增多，且細胞體積變大，維管柱的體積增大，約是野生擬南芥的2倍，木質(zhì)部明顯加厚。而轉(zhuǎn)反義PeTua3和PeTub3基因的擬南芥根系生長不正常，產(chǎn)生大量須根；石蠟切片顯示根系表皮薄壁細胞的數(shù)量明顯減少，且細胞體積變小，維管柱的體積變小，木質(zhì)部明顯比較薄。
　　5、在煙草懸浮細胞（BY-2）中過量表達PeTua3和PeTub3，與對照相比轉(zhuǎn)基因BY-2的G2期和 S期分裂時間明顯縮短，能顯著提高煙草細胞的有絲分

8、裂指數(shù)，細胞分裂加快。
　　細胞骨架微管蛋白基因PeTua3和PeTub3的體外表達蛋白能夠促進細胞生長，具有生物學活性，這在轉(zhuǎn)PeTua3和 PeTub3基因擬南芥中進一步得到證實，對轉(zhuǎn)PeTua3和PeTub3基因煙草懸浮細胞的觀察證實，PeTua3和PeTub3基因促進生長是通過縮短細胞分裂周期實現(xiàn)的。由此證明PeTua3和PeTub3基因具有促進細胞發(fā)育的功能，這意味著PeTua3和PeTub3基因?qū)τ诜肿佑N研究具有重要