幽門螺旋桿菌致胃上皮細(xì)胞氧化性DNA損傷和APE-1表達關(guān)系的體外實驗研究.pdf

1、目的：人類嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶(APE-1)是修復(fù)氧化性DNA堿基損傷關(guān)鍵酶，具有氧化還原作用，是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在修復(fù)由活性氧(ROS)引起的DNA損傷堿基切除修復(fù)通路中發(fā)揮核心作用。幽門螺旋桿菌(Hp)感染細(xì)胞可產(chǎn)生ROS及引起細(xì)胞內(nèi)DNA損傷，而APE-1在Hp對胃粘膜上皮細(xì)胞(GES-1)氧化性DNA損傷中的作用尚不明確。因此，我們以不同濃度的Hp及在不同時間感染GES-1細(xì)胞，檢測GES-1細(xì)胞中DNA損傷、8-OHdG

2、含量、ROS變化及其APE-1的表達，以探討Hp的致病機制致。
　　方法：⑴GES-1細(xì)胞培養(yǎng):GES-1細(xì)胞培養(yǎng)采用含10％的胎牛血清、2％的青鏈霉素的高糖DMEM進行細(xì)胞培養(yǎng)，在Hp感染GES-1細(xì)胞之前細(xì)胞培養(yǎng)基換用無青蓮霉素的含10％胎牛血清的高糖DMEM進行培養(yǎng)。⑵Hp的培養(yǎng)和活菌懸液制備:Hp固體培養(yǎng):選擇HpACTC43504(CagA+，VacA+)標(biāo)準(zhǔn)菌株，制備Hp活菌懸液，并進行鑒定。⑶Hp感染GES-1細(xì)胞模

3、型的建立:采用對數(shù)生長期的Hp感染GES-1細(xì)胞，取細(xì)菌細(xì)胞比100∶1，Hp感染GES-1細(xì)胞0h、1h、3h、6h、12h、24h;分別取細(xì)菌細(xì)胞比0、50∶1、100∶1、150∶1、200∶1、300∶1，Hp感染GES-1細(xì)胞6h。⑷DNA損傷檢測:采用單細(xì)胞凝膠電泳彗星實驗檢測DNA損傷和Elisa方法測量8-OHdG含量。⑸ROS水平檢測:裝載熒光探針熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)ROS變化和熒光酶標(biāo)儀定量測量細(xì)胞內(nèi)ROS含量。⑹

4、APE-1蛋白表達的檢測:用Western Blotting、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測APE-1蛋白表達變化和APE-1細(xì)胞內(nèi)定位情況。
　　結(jié)果：①Hp感染GES-1細(xì)胞DNA損傷和8-OHdG含量影響和變化:Hp感染細(xì)胞DNA損傷逐漸加重，隨著時間延長彗星拖尾越明顯，即損傷越明顯，細(xì)菌細(xì)胞比為100∶1感染至24h時彗星拖尾最長，DNA損傷最重（圖3.1，表3.1），各時間點之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);不同濃度Hp感染GES

5、-16h時，Hp濃度越高，拖尾越明顯，DNA損傷越重（圖3.2，表3.2），各濃度組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。8-OHdG含量相比空白組逐漸增加，隨著時間延長8-OHdG含量逐漸增加，至感染24h時8-OHdG含量最高（圖3.4，表3.3），且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);不同濃度Hp感染GES-1后，相比空白組8-OHdG含量均增加，濃度越高8-OHdG含量越高，至細(xì)菌細(xì)胞比為300∶1時8-OHdG含量最高（圖3.5

6、，表3.4），差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。②Hp感染GES-1細(xì)胞ROS水平變化:通過Hp感染GES-1后對細(xì)胞內(nèi)ROS定量檢測發(fā)現(xiàn)，24h內(nèi)空白組ROS含量無明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，細(xì)菌細(xì)胞比為100∶1時，ROS含量隨感染時間延長而逐漸增加，至感染24h時ROS含量達最大值（圖3.6，表3.5），差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);不同濃度Hp感染GES-1時，相比空白組ROS含量均增加，且Hp濃度越高ROS含量越高，至細(xì)菌細(xì)胞

7、比為300∶1時ROS含量最高（圖3.8，表3.6），各濃度組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。③Hp感染GES-1細(xì)胞APE1-1蛋白表達和細(xì)胞內(nèi)定位變化:未感染Hp的GES-1細(xì)胞隨時間變化未表現(xiàn)出明顯變化，APE-1蛋白表達灰度基本一致，通過灰度值分析差異無統(tǒng)計學(xué)意義;Hp感染GES-1以細(xì)菌細(xì)胞比為100∶1時，APE-1蛋白灰度值變化隨時間延長逐漸加深，至Hp感染GES-1細(xì)胞12h時灰度最深，感染24h時明顯低于12h灰度，

8、通過灰度值分析軟件可得出APE-1在感染GES-112h時APE-1蛋白表達最高（圖4.2，圖4.3），各時間組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);不同濃度Hp感染GES-1時，Hp感染GES-1后灰度均深于空白組，至300∶1時APE-1灰度最深，通過灰度值分析軟件300∶1時APE-1蛋白表達最高（圖4.4，圖4.5），差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05).另外通過免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果，APE-1在細(xì)胞質(zhì)中表達，Hp感染細(xì)胞后APE-1表達逐

9、漸增加，染色逐漸加深，至感染12h時染色最深，感染至24h時染色低于12h染色，通過平均光密度值分析，隨時間變化光密度值逐漸增加，感染24h的光密度值低于感染至12h的光密度值（圖4.7，表3.7），差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);不同濃度Hp感染細(xì)胞6h，感染Hp的細(xì)胞染色較空白組深，且Hp濃度越高染色越深，至300∶1時染色最深（圖4.9，表3.8），通過平均光密度分析，空白組低于實驗組光密度值，Hp濃度越高光密度值越高，差異

10、有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：通過體外實驗表明，Hp感染GES-1細(xì)胞可引起細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加、DNA損傷加重和8-OHdG含量增加，均與感染Hp濃度和感染Hp時間呈正相關(guān)。APE-1在細(xì)胞內(nèi)普遍表達，正常GES-1胞質(zhì)可表達APE-1，短時間感染Hp的GES-1細(xì)胞APE-1表達與DNA損傷和ROS含量呈正比例關(guān)系，APE-1蛋白表達增加，長時間感染Hp的GES-1細(xì)胞APE-1蛋白表達呈下降趨勢。APE-1蛋