MIR30B在幽門螺旋桿菌誘導的胃上皮細胞自噬調(diào)節(jié)與持續(xù)性感染發(fā)生中的機制研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因素，與胃粘膜相關淋巴組織淋巴瘤和胃癌的發(fā)病密切相關，WHO已將其列為第一類致癌因子。一般認為，H.pylori是一種胞外致病菌，但越來越多的證據(jù)顯示該菌能在胃上皮細胞中生存增殖，抗生素和機體免疫反應均不能清除胞內(nèi)的H.pylori而導致持續(xù)性感染引起胃部疾病的發(fā)生。深入闡明H.pylori慢性感染機制對揭示其致病機理、發(fā)展新的有效

2、的H.pylori感染治療手段具有重要的理論指導意義。
　　 自噬(Autophagy)是一種機體生存、分化、發(fā)育、代謝必需的溶酶體降解途徑，其主要的功能是保護機體免受各種致病因素的侵襲，并在抗病原微生物感染及其導致的炎癥中發(fā)揮重要作用。H.pylori感染可誘導胃上皮細胞產(chǎn)生自噬，而自噬抑制促進H。pylori的胞內(nèi)存活。
　　 microRNA(miRNA)是一類長度約19-24個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA分子，主要

3、存在于真核生物中，主要通過與靶mRNA3’端非翻譯區(qū)互補結(jié)合，誘導靶mRNA降解或抑制靶mRNA的翻譯，從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，H.pylori感染能夠引起胃上皮細胞miRNA表達譜發(fā)生變化：MIR155、MIR16、MIR146A、MIR30B、MIR222等表達出現(xiàn)升高，MIR90B等則表達下調(diào)(J Infect Dis2009，16-25)，且MIR155和MIR146A有負性調(diào)控胃上皮細胞表達促炎癥因子的

4、作用。同時，MIR30B不僅在體外感染模型中表達升高，而且在臨床活檢標本中也觀察到MIR30B表達量在H。pylori感染組胃粘膜組織顯著高于未感染組。另外，在H.pylori感染誘導胃上皮細胞自噬模型中，我們通過免疫印跡和激光共聚焦顯微鏡技術發(fā)現(xiàn)，MIR30B能明顯抑制自噬信號蛋白LC3的Ⅰ型向Ⅱ型轉(zhuǎn)變，以及抑制GFP-LC3的熒光蛋白聚集，提示MIR30B參與了H.pylori引起的自噬調(diào)控。那么MIR30B是通過什么機制來抑制自噬

5、的形成呢？目前尚不清楚。BECN1和ATG12作為自噬信號通路上的兩個重要分子，在自噬發(fā)生過程中發(fā)揮關鍵作用。生物信息學分析顯示：它們可能是MIR30B的靶標蛋白。為此，我們提出MIR30B調(diào)節(jié)幽門螺桿菌誘導的胃上皮細胞自噬與持續(xù)性感染的如下機制設想：MIR30B通過調(diào)節(jié)自噬通路中的信號蛋白BECN1和ATG12而發(fā)揮抑制作用，從而影響到H.pylori被清除，導致H.pylori在自噬體中生存繁殖而發(fā)生持續(xù)感染，引起慢性胃炎、消化性潰

6、瘍，甚至胃癌等疾病。本研究通過H.pylori感染人胃上皮細胞自噬模型和臨床胃粘膜標本的檢測，以MIR30B為研究對象，采用實時定量PCR技術對其表達進行鑒定；分別轉(zhuǎn)染MIR30B模擬物及抑制劑上調(diào)和下調(diào)胞內(nèi)MIR30B的水平，采用Western-blot、激光共聚焦、電鏡等技術觀察MIR30B在H.pylori感染中的自噬變化；結(jié)合生物信息學和螢光素酶實驗等鑒定MIR30B的靶基因--BECN1和ATG12；并進一步通過慶大霉素保護實

7、驗和免疫熒光實驗研究MIR30B抑制自噬對胞內(nèi)H.pylori的清除作用。獲得以下研究結(jié)果：
　　 1.在H.pylori感染人胃上皮AGS細胞模型中，通過miRNA芯片和實時定量PCR觀察到H.pylori感染后MIR30B表達上調(diào)；同時在人胃粘膜組織中得到了驗證。
　　 2.H.pylori感染能夠誘導AGS細胞自噬，電鏡和慶大霉素保護性實驗證實H。pylori能夠在AGS細胞內(nèi)存在，抑制自噬可促進H.pylori的

8、胞內(nèi)存活。
　　 3.預測并鑒定了MIR30B的靶基因：BECN1和ATG12，證實MIR30B通過轉(zhuǎn)錄水平抑制其靶基因從而擾亂自噬。
　　 4.與未感染H.pylori人群相比，感染陽性的病人自噬水平降低，同時MAP1LC3B的蛋白水平以及BECN1和ATG12 mRNA表達量明顯下降，并且與MIR30B呈負相關。
　　 5.MIR30B可通過抑制其靶蛋白有利于H.pylori在胞內(nèi)的存活。
　　 固有

9、免疫應答作為機體抵抗病原微生物感染的一種重要的防衛(wèi)機制，在抵抗H。pylori感染中發(fā)揮重要的作用。髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor88，MYD88)是Toll樣受體信號轉(zhuǎn)導通路中的一個關鍵銜接分子。研究表明MYD88參與調(diào)控H.pylori感染過程中的TLR信號通路。前期研究發(fā)現(xiàn)，在H.pylori感染所致炎癥反應中，誘導宿主表達升高的MIR155能通過抑制靶蛋白的表達而負性調(diào)控促炎癥因子

10、的表達。生物信息學分析提示，MYD88可能是MIR155的靶蛋白。本文首先通過螢光素酶實驗和熒光蛋白實驗鑒定了MYD88是MIR155的靶蛋白，并采用Western-blot和實時定量PCR技術證實了MIR155通過抑制MYD88的翻譯發(fā)揮作用；進一步，采用siRNA干擾技術、轉(zhuǎn)染MIR155模擬物及抑制劑，通過ELISA和實時定量PCR技術分別在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測促炎癥因子IL-8的表達情況，證實MIR155在幽門螺桿菌感染中通過