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1、目的:預(yù)測(cè)并擬定靶向作用于TLR4基因(TLR4 mRNA)的miRNA。觀察所擬定的miRNA對(duì)巨噬細(xì)胞表達(dá)炎癥介質(zhì)的影響并探討其機(jī)制。
方法:通過(guò)生物信息學(xué)方法分析TLR4 mRNA3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)序列的二級(jí)結(jié)構(gòu),同時(shí)利用在線預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)擬定可能靶向作用于TLR4基因的miRNA。通過(guò)ELISA測(cè)定巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。采用qPCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)擬定miRNA相對(duì)表
2、達(dá)量。使用RT-PCR測(cè)定巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)水平。通過(guò)western blot檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4蛋白水平。運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)分析擬定miRNA與TLR4 mRNA的靶向結(jié)合活性。
結(jié)果:⑴經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)擬定miR-181a作為靶向調(diào)控TLR4基因(TLR4 mRNA)的待驗(yàn)證miRNA。⑵在巨噬細(xì)胞被轉(zhuǎn)染2.5nM、5.0nM、10.0nM的miR-18
3、1a mimic及對(duì)照的mimic,待0h、24h、48h、72h后,再分別予LPS刺激(時(shí)限為6h),發(fā)現(xiàn)miR-181a mimic轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均較相應(yīng)對(duì)照組及0h組顯著降低(均P<0.05),尤其以5.0nM、48h組最為明顯;但當(dāng)巨噬細(xì)胞被轉(zhuǎn)染2.5nM、5.0nM、10.0nM的miR-181a inhibitor及對(duì)照的inhibitor時(shí),0h、24h、48h、72h后,再分別予LPS
4、刺激(時(shí)限為6h),則發(fā)現(xiàn)miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均較其對(duì)照組及0h組顯著升高(均P<0.05),其中以5.0nM、48h組最為明顯。⑶在巨噬細(xì)胞分別被轉(zhuǎn)染5.0nM的miR-181a mimic(或?qū)φ盏膍imic)和miR-181a inhibitor(或?qū)φ盏膇nhibitor)48h,接著予LPS刺激6h后,發(fā)現(xiàn)miR-181a mimic轉(zhuǎn)染組與其對(duì)照組相比,細(xì)胞內(nèi)
5、miR-181a相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05),而miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染組與其對(duì)照組相比,細(xì)胞內(nèi) miR-181a相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05),同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-181a mimic和miR-181a inhibitor處理組與各自對(duì)照組相比,細(xì)胞內(nèi)TLR4 mRNA表達(dá)水平均無(wú)顯著差異(均P>0.05),但miR-181a mimic處理組與其對(duì)照組相比,細(xì)胞內(nèi)TLR4蛋白水平及TNF-α、IL-1
6、β、IL-6 mRNA表達(dá)水平均顯著降低(均P<0.05),而miR-181a inhibitor處理組與其對(duì)照組相比,細(xì)胞內(nèi)TLR4蛋白水平及TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(均P<0.05)。⑷通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)發(fā)現(xiàn):miR-181a mimic轉(zhuǎn)染組T293細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05);miR-181a mimic+miR-181a inhibitor共轉(zhuǎn)染組T293細(xì)胞內(nèi)熒光
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