基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1在組織工程修復(fù)軟骨損傷時(shí)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞募集和促進(jìn)分化的作用.pdf

1、研究背景：由于關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)無(wú)血管分布,且軟骨細(xì)胞被周圍基質(zhì)成分所包圍,因此軟骨損傷后通常會(huì)發(fā)生不可逆的病理過(guò)程,引起關(guān)節(jié)功能改變。目前尚無(wú)結(jié)構(gòu)、成分、力學(xué)性質(zhì)與正常關(guān)節(jié)軟骨類似的再生透明軟骨,關(guān)節(jié)軟骨損傷后修復(fù)仍是骨科學(xué)沒(méi)有解決的難題。目前的多種治療力‘法,如微骨折術(shù)、自體或異體組織（骨膜、軟骨膜、骨軟骨塊）移植等,存在種種缺陷從而限制其臨床應(yīng)用,并且不能獲得滿意的治療效果。應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建組織工程軟骨或骨軟骨復(fù)合體被認(rèn)為是目前最有可

2、能解決此難題的技術(shù)手段。組織工程包括三大因素:種子細(xì)胞、支架材料和信號(hào)因子。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)具有多向分化潛能,已經(jīng)被證實(shí)能夠向骨、軟骨等多種組織分化:由丁.體外培養(yǎng)細(xì)胞有失分化的風(fēng)險(xiǎn),因此動(dòng)員體內(nèi)自體BMSCs修復(fù)軟骨損傷是治療軟骨損傷的熱點(diǎn)。SDF-1是骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的一種重要趨化因子,在神經(jīng)、造血、血管形成、免疫與腫瘤發(fā)生及進(jìn)展等方面發(fā)揮重要的作用。CXC

3、R4為SDF-1的唯一受體,分布于多種細(xì)胞表面的唯‘的特異性受體CXCR4結(jié)合。體內(nèi)研究表明,造血干細(xì)胞的歸巢能力與骨髓基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌的SDF-1有關(guān),也與其本身表達(dá)CXCR4強(qiáng)弱有關(guān)。SDF-1能有效地維持細(xì)胞增殖周期,促使更多的細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)增殖狀態(tài);SDF-I在不同的細(xì)胞群體或在不同的環(huán)境中發(fā)揮不同的作用,目前機(jī)制還不清楚,尚需要更多研究去證實(shí)。所以本研究重點(diǎn)集中于SDF-I能否募集BMSCs并促進(jìn)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化。

4、組織T程修復(fù)軟骨過(guò)程中,支架不僅起著同定和運(yùn)載細(xì)胞的作用,其性質(zhì)與孔徑也會(huì)影響到細(xì)胞的性質(zhì)和功能。目前已有多種支架用于軟骨組織工程來(lái)修復(fù)軟骨損傷,常用的有聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸一羥基乙酸(PLGA)、膠原、殼聚糖等。PLGA海綿支架是已被美國(guó)食品和藥物管理局(FoodandDrugAdministrationFDA)批準(zhǔn)可用于臨床的醫(yī)用材料。PLGA海綿支架有相互交通的三維空間,為細(xì)胞提供了廣闊的生存環(huán)境,而且能

5、夠允許細(xì)胞在三維空間中運(yùn)動(dòng)和遷移,克服了體外單層培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞接觸抑制現(xiàn)象;三維空間相互交通,可以允許細(xì)胞間進(jìn)行信息傳遞、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)等:同時(shí),細(xì)胞和細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)可以被限制在支架的三維結(jié)構(gòu)巾,有利于新生組織的結(jié)構(gòu)改建和整合。綜上,本實(shí)驗(yàn)欲利用PLGA海棉支架附載SDF-I,募集自體BMSCs,并利用軟骨缺損部位微環(huán)境促進(jìn)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化修復(fù)軟骨缺損。因此本實(shí)驗(yàn)的研究?jī)?nèi)容有:第一,體內(nèi)外驗(yàn)證SDF-1對(duì)BMSC

6、s的趨化效應(yīng);第二,驗(yàn)證利用SDF-1促進(jìn)BMSCs表達(dá)軟骨特征蛋白,II型膠原及糖胺多糖;第三,利用附載SDF-1的PLGA支架修復(fù)軟骨缺損,以期為關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療提供新思路,探索一條新途徑。
　　 方法：(l)分離、培養(yǎng)、并用流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSCs。(2)利用免疫組化方法驗(yàn)證SDF-1的特異抗體在BMSCs的分布。(3)體外利用Transwell板檢測(cè)SDF-I對(duì)BMSCs的趨化效應(yīng)。(4)體外BrdU標(biāo)記BMSCs。(

7、5)用附載SDF-1的PLGA支架植入軟骨缺損動(dòng)物模型中,驗(yàn)證SDF-I在體內(nèi)對(duì)BMSCs的募集效應(yīng)。(6)體外不同濃度SDF-I與BMSCs共培養(yǎng),用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timePCR),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡法(Westernblotting)檢測(cè)BMSCs表達(dá)II型膠原及糖胺多糖的情況。(7)將成年雄性新兩蘭大白兔60只,隨機(jī)分為4組:GroupD（缺損對(duì)照組）、GroupP（PLGA支架）、Grou

8、pSP（SDF-1+PLGA支架）、GroupAP（AMD+PLGA支架）;建立雙膝關(guān)節(jié)股骨滑車軟骨缺損模型（直徑4mm,深度3mm）,用附載SDF-I的PLGA支架植修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損動(dòng)物模型。術(shù)后4W,8W,12W利用國(guó)際軟骨修復(fù)學(xué)會(huì)(ICRS)大體和組織學(xué)評(píng)分驗(yàn)證各組的修復(fù)效果。定量結(jié)果用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS軟件采用Mann-Whitney檢驗(yàn),p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義:組織學(xué)ICRS評(píng)分結(jié)果用中位數(shù)士四分

9、位間距（medians±interquartilerangeM±QR）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用秩和檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù),P＜0.008為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：采用全骨髓貼壁培養(yǎng)BMSCs,分離培養(yǎng)后采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSC,CD90、CD44呈陽(yáng)性,而血液米源分子表面標(biāo)記CD14、CD45呈陰性。免疫組織化學(xué)證明,SDF-I的特異性抗體分布于BMSCs表面。體外Transwell趨化實(shí)驗(yàn)表明,隨著SDF-I濃度增加,趨化的細(xì)胞數(shù)逐漸增多,

10、當(dāng)SDF-I濃度為50ng/ml時(shí),遷移細(xì)胞數(shù)達(dá)峰值。為驗(yàn)證SDF-1在體內(nèi)可以募集BMSCs,將BMSCs體外BrdU標(biāo)記,從靜脈注入軟骨缺損模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)SDF-I的附載濃為50ng/ml時(shí)募集的BrdU標(biāo)記的BMSCs最多。體外SDF-I與BMSCs共培養(yǎng),RT-PCR,ELISA、WESTERN-bloting檢測(cè)結(jié)果示,SDF-1刺激濃度為50ng/ml時(shí),BMSCs表達(dá)II型膠原及糖胺多糖明顯比對(duì)照組高。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

11、,術(shù)后12W,附載SDF-I+PLGA支架組,軟骨表面平整,缺損由透明組織修復(fù),內(nèi)有大量軟骨細(xì)胞,表層細(xì)胞平行于表面,深層細(xì)胞成柱狀排列,趨于正常,可見軟骨下潮線;與周圍正常軟骨界線消失。甲苯胺藍(lán)染色和II型膠原染色均為陽(yáng)性:ICRS組織學(xué)評(píng)分結(jié)果示,術(shù)后4W、8W,SDF-I+PLGA支架組修復(fù)效果與裸支架組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.008）;術(shù)后12W,附載SDF-I+PLGA支架組修復(fù)效果明顯優(yōu)于裸支架組（P=o.001）;在同一

12、時(shí)間點(diǎn),附載SDF-I+PLGA支架組修復(fù)效果優(yōu)于對(duì)照組（軟骨缺損組）(P＜0.008)。
　　 結(jié)論：(l)SDF-I體內(nèi)外可募集BMSCs。(2)SDF-1（50ng/ml）與BMSCs共培養(yǎng)后,可促進(jìn)BMSCs分泌II型膠原及糖胺多糖,有助于BMSCs向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。(3)用附載SDF-1(50ng/ml)的PLGA支架復(fù)合體治療軟骨缺損,結(jié)果表明,附載SDF-1(50ng/ml)的PLGA支架復(fù)合體可以明顯促進(jìn)軟骨缺損修