連翹酯苷A的免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　通過觀察連翹酯苷 A(forsythoside A, FA)對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+regulatory T cell,Treg)百分率、脾臟Foxp3基因表達(dá)、血清中IL-10和TGF-β1含量的影響;及對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞48h后細(xì)胞生存率、Treg百分率、轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)、細(xì)胞因子IL-10和TGF-β1分泌的影響;探討連翹酯苷A的免疫調(diào)節(jié)作用及其可能機(jī)制。

2、
　　方法:
　　1連翹酯苷A對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠Treg的影響
　　1.1模型建立:通過腹腔注射LPS10mg/kg,建立內(nèi)毒素血癥小鼠模型。
　　1.2實(shí)驗(yàn)分組:隨機(jī)分配48只BALB/c小鼠為正常對(duì)照組(Control),內(nèi)毒素
　　模型組(LPS),CD25抗體組(anti-CD25),FA高、中、低劑量組共6組;Control、LPS、anti-CD25組均腹腔注射生理鹽水0.5 ml/d,連續(xù)7天;

3、其中anti-CD25組第二天腹腔注射anti-CD251.2mg/kg耗竭Treg為陽性對(duì)照;FA高、中、低劑量組分別腹腔注射FA80mg/kg、20mg/kg、5mg/kg,連續(xù)7天;第8天Control組仍腹腔注射生理鹽水,其他組均腹腔注射 LPS10mg/kg,4h后留取外周血和脾組織待測(cè)。
　　1.3各項(xiàng)指標(biāo)的觀察和檢測(cè):①觀察小鼠一般表現(xiàn)情況;②流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Treg百分率;③Real-Time PCR檢測(cè)脾臟F

4、oxp3mRNA的表達(dá);④Western blot檢測(cè)脾臟Foxp3蛋白的表達(dá);⑤ELISA檢測(cè)外周血清IL-10、TGF-β1的含量。
　　2連翹酯苷A對(duì)LPS作用的小鼠淋巴細(xì)胞的影響
　　2.1提取原代淋巴細(xì)胞:無菌取脾,于200目網(wǎng)上小心研磨,并用400目網(wǎng)過濾,采用密度梯度離心法,制備原代單細(xì)胞懸液。
　　2.2實(shí)驗(yàn)分組:將實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(Control),內(nèi)毒素模型組(LPS),FA高、中、低劑量組,多黏

5、菌素B組(PMB)共6組。Control組常規(guī)培養(yǎng);LPS組加100ng/ml LPS刺激48h;FA高、中、低劑量組和PMB組分別加入FA320ug/ml、80ug/ml、20ug/ml及PMB10ug/ml預(yù)處理細(xì)胞2h,再給予100ng/ml LPS刺激48h。
　　2.3各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè):①M(fèi)TT法檢測(cè)細(xì)胞存活率;②流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)總淋巴細(xì)胞中Treg百分率;③Real-Time PCR檢測(cè)細(xì)胞中Foxp3mRNA的表達(dá);④

6、Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Foxp3蛋白的表達(dá);⑤ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-10、TGF-β1的含量。
　　結(jié)果:
　　1連翹酯苷A對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠Treg的影響
　　1.1小鼠一般表現(xiàn)情況:造模后,LPS組小鼠比正常組精神萎靡,抓取時(shí)反應(yīng)遲鈍;抗體和FA干預(yù)組小鼠變化不明顯。
　　1.2小鼠外周血 Treg百分率變化:LPS組小鼠外周血 Treg比例大幅上升(P<0.01);與LPS組相比,FA高

7、劑量干預(yù)明顯使外周血Treg比例降低(P<0.01)。
　　1.3小鼠脾組織 Foxp3mRNA和蛋白的表達(dá):與 Control組比, LPS組Foxp3mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01);用anti-CD25或FA干預(yù),Foxp3mRNA表達(dá)量明顯下降(P<0.01,P<0.05)。FA三組呈劑量依賴關(guān)系,實(shí)驗(yàn)各組 Foxp3蛋白表達(dá)的變化與Foxp3mRNA相似。
　　1.4小鼠血清中IL-l0和TGF-β1的水平:L

8、PS組小鼠的IL-10含量明顯高于Control組,差異十分顯著(P<0.01);anti-CD25耗竭Treg及FA干預(yù)可有效降低小鼠血清IL-10水平(P<0.01,P<0.05)。TGF-β1變化不如IL-10明顯。
　　2連翹酯苷A對(duì)LPS作用的小鼠淋巴細(xì)胞的影響
　　2.1細(xì)胞生存率的變化:相比于Control組,LPS組細(xì)胞存活率顯著性下降(P<0.01);高、中、低劑量FA預(yù)處理均可明顯提高細(xì)胞存活率(P<0.

9、01,P<0.05),且存在劑量依賴性;其中FA高劑量組與Control組比無顯著性差異(P>0.05)。
　　2.2總淋巴細(xì)胞中Treg百分率變化:Control組中Treg比例為5％~10%,LPS組Treg比例上升十分顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);用PMB及FA干預(yù)后比例下降且FA三組呈劑量依賴關(guān)系(P<0.05)。
　　2.3 Foxp3mRNA和蛋白的表達(dá):Control組細(xì)胞表達(dá)少量Foxp3mRNA,

10、給予LPS刺激48h,Foxp3mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01);各劑量FA都能不同程度的降低Foxp3mRNA的表達(dá)(P<0.05),以高濃度FA作用最顯著(P<0.01)。蛋白表達(dá)的變化與Foxp3mRNA相似。
　　2.4 IL-10和TGF-β1的水平:給予LPS刺激后,細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子IL-10和TGF-β1的含量明顯升高(P<0.01),FA干預(yù)可降低其水平(P<0.05),對(duì)TGF-β1的影響不如IL-10明