ApoE-LDLR雙基因缺失小鼠炎癥相關基因的表達研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種發(fā)生于動脈血管的疾病。是導致冠心病、心肌梗塞等心腦血管病的主要原因，嚴重危害著人類健康，在西方發(fā)達國家和我國一直是主要的死亡原因之一。AS是一種多因素疾病，它受多種遺傳因素和外界因素的影響。目前普遍被認為AS是由血脂代謝異常等多種因素引發(fā)的一種慢性炎癥性疾病，它涉及多種細胞類型和多種生物學過程參與，如脂類代謝、細胞粘連、應激反應、細胞增殖和凋亡以及血液凝集，在每一生物學過程中又涉

2、及多種基因參與和調控。研究這些基因在AS發(fā)生發(fā)展過程中動態(tài)的時序表達特征以及它們之間的相互作用機理，將有助于弄清該病的發(fā)病機理。 載脂蛋白E(apolipoprotein E，aopE)和低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor,LDLR)雙基因缺失(apoE-/-/LDLR-/-)小鼠由于apoE和LDLR雙基因缺失引起的apoE及其主要受體途徑受阻，普通飲食條件下就能表現(xiàn)出顯著的高脂

3、血癥和AS病變，是目前比較常用的一種AS模型小鼠。但目前對apoE-/-/LDLR-/-小鼠和AS的研究多集中于血脂代謝方面，與血管炎癥損傷的關系以及AS發(fā)病的炎癥反應機制仍不完全明確，尤其在AS早期，apoE和LDLR雙基因缺失引發(fā)的脂代謝紊亂與血管炎癥損傷的關系以及AS的炎癥機制仍待進一步研究。 本實驗以apoE-/-/LDLR-/-小鼠為模型，利用逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polym

4、erase chain reaction，RT-PCR)以及實時定量RT-PCR技術檢測炎癥相關的重要基因在不同年齡段與野生型(wild type，WT)小鼠肝臟和主動脈中的時序表達差異，同時檢測血脂和血清中炎癥因子的變化，觀察肝臟和主動脈內膜的病理形態(tài)改變，綜合分析上述變化與AS發(fā)生發(fā)展的關系。結果顯示： 1)小鼠肝臟RT-PCR結果：14天和1月齡時apoE-/-/LDLR-/-小鼠肝臟中的C反應蛋白(C-reactive

5、protein，CRP)表達量較同齡WT小鼠顯著升高(P<0.05)，但隨著年齡的增長，表達量逐漸降至WT水平。14天齡時apoE-/-/LDLR-/-小鼠肝臟中的白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)和1月齡時肝臟中的腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達量均顯著高于同齡的WT小鼠(P<0.05)，并隨著年齡的增長表達量逐漸升高，分別于3和2月齡時達到峰值。甘露聚糖結合凝集

6、素(mannose binding lectin，MBL)在各年齡段apoE-/-/LDLR-/-小鼠中的表達量與同齡WT小鼠相比均無顯著差異。WT小鼠肝臟中所有靶基因各年齡段之間均無顯著變化。 2)主動脈RT-PCR結果：1月齡apoE-/-/LDLR-/-小鼠主動脈中IL-1β、Toll樣受體2(toll-like receptor-2，TLR2)、單核趨化蛋白1(monocyte chemotacticprotein-1，

7、MCP-1)、細胞間粘附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管粘附分子1(vascular adhesion molecule-1，VCAM-1)、GM-CSF、CD36和內皮素1(endothelin-1，ET-1)表達量均較同齡WT小鼠顯著升高(P<0.05，P<0.01)。2月齡apoE-/-/LDLR-/-小鼠主動脈中IL-1β、TLR2、MCP-1、ICAM-1、血小板

8、衍生生長因子-α(platelet derived growth factor-α，PDGF-α)和TNF-α和表達量繼續(xù)升高，GM-CSF和CD36與1月齡小鼠相比無明顯差異，而ET-1和VCAM-1表達量降至WT小鼠水平。3月齡apoE-/-/LDLR-/-小鼠主動脈中PDGF-α、TNF-α繼續(xù)升高，IL-1β、GM-CSF和CD36與2月齡相比變化不大，MCP-1較2月齡略有下降，TLR2和ICAM-1降至WT小鼠水平。核轉錄因

9、子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和κB抑制劑(inhibitor-κB，I-κB)在各年齡段apoE-/-/LDLR-/-小鼠中的表達量與同齡WT小鼠相比均無顯著差異。WT小鼠中除IL-1β在2、3月齡較1月齡輕微上調外，其余基因各年齡段之間均無顯著變化。實時定量RT-PCR結果與半定量RT-PCR結果基本吻合。 3)血生化學檢測：各年齡階段apoE-/-/LDLR-/-小鼠總膽固醇(total cho

10、lesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)以及高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)，TNF-α，IL-1β和氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，OxLDL)水平明顯高于同齡WT小鼠(P<0.05，P<0.01)。除OxLDL外均隨年齡增長持續(xù)上升，在3月齡

11、時達到最高，TC和LDL水平分別比WT小鼠升高約6倍和40倍，TG、HDL、HDL、TNF-α、IL-1β及OxLDL水平較同齡WT小鼠高出2-3倍。 4)病理形態(tài)學檢測：1月齡apoE-/-/LDLR-/-小鼠主動脈內膜可觀察到散在的輕微的脂質沉積病變；肝臟可觀察到明顯的肝臟脂肪變性，大小不等的脂肪滴出現(xiàn)于肝細胞質內。隨年齡的增長至2和3月齡時，主動脈內膜病變區(qū)域增多，內膜增厚：肝細胞中的脂肪滴較1月齡時明顯增多，肝臟脂肪變性

12、程度加重，小不等的脂肪滴充滿于肝細胞質內。14天齡apoE-/-/LDLR-/-小鼠以及各年齡段的WT小鼠主動脈均未觀察到明顯的蘇丹Ⅳ陽性染色區(qū)，肝臟中未觀察到明顯的油紅O陽性染色區(qū)。以上結果提示：ApoE-/-/LDLR-/-小鼠小鼠肝臟和主動脈中部分時序表達上調的炎癥相關基因以及血清中升高的TNF-α、IL-1β及OxLDL，推測與血脂紊亂、肝臟脂肪變性以及主動脈AS病變形成密切相關，apoE和LDLR雙基因缺失形成的高脂血癥可能通