加味小柴胡湯抗實(shí)驗(yàn)性肝損傷及肝細(xì)胞凋亡作用的研究.pdf

1、1.研究意義與目的：肝損傷是多種肝臟疾病共有的一種病理變化，其長期存在往往是導(dǎo)致肝纖維化，甚至肝硬化、肝癌發(fā)生的重要始動(dòng)因素。因此防治肝損傷是臨床肝病治療的主要環(huán)節(jié)之一。肝損傷機(jī)制復(fù)雜，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，對(duì)肝損傷的認(rèn)識(shí)已進(jìn)入到細(xì)胞分子水平，對(duì)中醫(yī)防治肝損傷作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)也由保護(hù)肝細(xì)胞膜、降低轉(zhuǎn)氨酶等淺層面逐漸深入。近年來的研究表明，相比其他機(jī)制來講，細(xì)胞凋亡在肝細(xì)胞損傷中發(fā)揮著更為重要的作用。Caspase(半胱天冬酶)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

2、調(diào)控通路分成細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)通路，細(xì)胞外通路通過細(xì)胞膜途徑，細(xì)胞內(nèi)通路通過線粒體途徑，這個(gè)為當(dāng)前肝損傷凋亡機(jī)理研究當(dāng)中的一個(gè)重要研究內(nèi)容，而中醫(yī)藥在此方向的研究較為分散，尚未形成體系。 小柴胡湯出自《傷寒論》，在長期的醫(yī)療實(shí)踐中，廣泛用于肝膽、消化、免疫等系統(tǒng)疾病的治療。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為引起肝損傷的病因多為感受時(shí)邪，或飲酒過度，或情志失調(diào)，或久病體虛等，脾虛、陰虛及瘀血是其常見的病理改變，但小柴胡湯中健脾、養(yǎng)陰及活血的藥力卻顯不足。

3、 依據(jù)導(dǎo)師的臨床經(jīng)驗(yàn)，本課題在原方基礎(chǔ)上加入茯苓、白術(shù)、白芍、當(dāng)歸、丹參等健脾、養(yǎng)陰及活血中藥構(gòu)成加味小柴胡湯。根據(jù)中醫(yī)防治肝損傷作用機(jī)制研究趨勢(shì)，以刀豆蛋白、醋氨酚、D-氨基半乳糖、酒精所致肝損傷模型，評(píng)價(jià)與比較加味小柴胡湯的抗肝損傷作用，并通過對(duì)信號(hào)通路調(diào)節(jié)相關(guān)基因及其表達(dá)的檢測(cè)，探索加味小柴胡湯對(duì)小鼠肝損傷中肝細(xì)胞凋亡細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。 2.方法：2.1兩種小柴胡湯急性毒性實(shí)驗(yàn)(改進(jìn)寇氏法)：實(shí)驗(yàn)前把小白鼠隨

4、機(jī)分為小柴胡湯80g/kg/d組、40g/kg/d組、20g/kg/d組、10g/kg/d組，加味小柴胡湯80g/kg/d組、40g/kg/d組、20g/kg/d組、10g/kg/d組，同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組。加味小柴胡湯及小柴胡湯均按80、40、20、10g/kg/d的劑量配制給藥，正常對(duì)照組用等量生理鹽水灌胃。給藥后觀察5天，逐日記錄中毒癥狀、死亡情況，死亡動(dòng)物應(yīng)及時(shí)尸解，記錄病變情況，若肉眼可見病變組織時(shí)，進(jìn)行該組織的病理形態(tài)學(xué)檢查。給

5、藥后同時(shí)觀察動(dòng)物死亡數(shù)、聳毛、蜷臥、耳廓蒼白或充血、突眼、步履蹣跚。大小便情況、癱瘓、昏迷、抽搐、驚厥、步態(tài)、呼吸困難等情況。通過上述實(shí)驗(yàn)的觀察，以測(cè)定不同濃度的加味小柴胡湯及小柴胡湯對(duì)小鼠的毒副作用，從而確定試驗(yàn)的劑量范圍。 2.2兩種小柴胡湯對(duì)刀豆蛋白A所致肝損傷的保護(hù)作用：將NIH雄性小鼠分為加味小柴胡湯大、中、小劑量組、正常組、聯(lián)苯雙酯組、模型組及小柴胡湯組。分別于首日上、下午和次日下午按加味小柴胡湯40、20、10g/

6、kg/d，小柴胡湯40g/kg/d，聯(lián)苯雙酯150mg/kg/d劑量各灌胃給藥一次，每次0.2ml，正常組和模型組給予蒸餾水。末次給藥后4h，除正常組，其余各組小鼠均一次性尾靜脈注射ConA20mg/kg，禁食，不禁水，建立ConA致小鼠肝損傷的動(dòng)物模型。8h后摘小鼠眼球取血，不抗凝取血清。血清獲取后分為兩部分，分別置于-20℃和-70℃冰箱中保存。取肝左葉組織，10％甲醛溶液固定。通過對(duì)肝損傷小鼠的ALT、AST、腫瘤壞死因子(TNF

7、-α)、小鼠干擾素γ(IFN-γ)，以及對(duì)肝組織的病理學(xué)檢查，探討及比較兩種小柴胡湯可能的保肝降酶、TNF-α、IFN-γ含量的改變、防止肝損傷的作用和機(jī)理所在。 2.3加味小柴胡湯對(duì)醋氨酚所致肝損傷的保護(hù)作用：將NIH小鼠分為正常組、模型組、加味小柴胡湯大、中、小劑量組及聯(lián)苯雙酯組。分別給小鼠以加味小柴胡湯40、20、10g/kg/d，聯(lián)苯雙酯150mg/kg/d劑量連續(xù)灌胃10d，空白組及模型組給予生理鹽水，每次0.2ml/

8、只?？瞻讓?duì)照組在最后一次灌胃6h后腹腔注射生理鹽水。其余各組在最后一次灌胃6h后腹腔注射醋氨酚300mg/Kg鼠重以建立醋氨酚致小鼠肝損傷的動(dòng)物模型，各組在腹腔注射生理鹽水及醋氨酚16h后摘小鼠眼球取血進(jìn)行生化測(cè)試，同時(shí)留取肝組織作組織學(xué)檢查。通過對(duì)肝損傷小鼠的脂質(zhì)過氧化物(LPO)、谷胱甘肽(GSH)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、細(xì)胞凋亡的DNA梯形條帶檢測(cè)等指標(biāo)的檢測(cè)，以及對(duì)肝組織的病理學(xué)檢查，探討加味小柴胡湯的

9、抗氧化、防止肝損傷的作用和機(jī)理。 2.《加味小柴胡湯對(duì)D一氨基半乳糖所致肝損傷的保護(hù)作用：將NIH小鼠60只分為正常組、模型組、加味小柴胡湯大、中、小劑量組及聯(lián)苯雙酯組。分別給小鼠以加味小柴胡湯40、20、10g/kg/d，聯(lián)苯雙酯150mg/kg/d灌胃，正常組、模型組以等體積生理鹽水灌胃，共7天，第6天，模型組和治療組按0.5g/kg劑量腹腔注射D-氨基半乳糖，建立D一氨基半乳糖致小鼠肝損傷的動(dòng)物模型，正常組同時(shí)腹腔注射等體

10、積生理鹽水。腹腔注射24h后，摘眼球取血，分離血清。小鼠處死后，迅速取出肝臟。通過對(duì)肝損傷小鼠的ALT、AST、SOD、MDA、NO，半定量RT-PCR法檢測(cè)Fas及FasL基因mRNA表達(dá)以及肝組織病理檢查等指標(biāo)的檢測(cè)，探討加味小柴胡湯的保肝降酶、抗氧化、防止肝損傷及肝細(xì)胞凋亡的作用和機(jī)理所在。2.5加味小柴胡湯對(duì)酒精所致急性肝損傷的保護(hù)作用：將NIH小鼠分為正常組、模型組、加味小柴胡湯大、中、小劑量組。治療組按加味小柴胡湯40、20

11、、10g/kg/d劑量，0.2ml/只經(jīng)口灌胃，正常組、模型組以等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)30d。末次經(jīng)口灌胃給藥20min后，正常組給予生理鹽水，其余各組小鼠均經(jīng)口一次給予乙醇6.5g/kg，建立急性酒精性肝損傷模型，并觀察動(dòng)物的一般表現(xiàn)。16h后剖殺小鼠，摘眼球取血，分離血清。小鼠處死后，迅速取出肝臟。通過檢測(cè)小鼠MDA、GSH，半定量RT-PCR法檢測(cè)Bax/Bc1-2基因mRNA表達(dá)以及肝組織病理檢查，從而觀察加味小柴胡湯對(duì)急性酒

12、精性肝損傷的保護(hù)作用，探討其對(duì)肝損傷保護(hù)的作用機(jī)理，為臨床運(yùn)用加味小柴胡湯治療急性酒精性肝損傷提供科學(xué)的依據(jù)。 3.結(jié)果3.1兩種小柴胡湯急性毒性實(shí)驗(yàn)(改進(jìn)寇氏法)：小柴胡湯及加味小柴胡湯80g/kg/d組顯示了一定的不良反應(yīng)。從第2天下午開始，動(dòng)物表現(xiàn)為蜷臥，乏力，納差，行動(dòng)遲緩，飲水量少，毛發(fā)較濕，大便溏泄。小柴胡湯80g/kg/d組第4天死亡2只，第5天死亡一只，加昧小柴胡湯80g/kg/d組第4天及第5天各死亡1只。經(jīng)解

13、剖未見明顯病變。究其原因可能為藥物的濃度過大過稠，影響小鼠的飲食及飲水，從而導(dǎo)致以上癥狀。40、20、10g/kg/d劑量的小柴胡湯及加味小柴胡湯對(duì)小鼠未見明顯影響，小鼠活動(dòng)自如，毛發(fā)干燥，飲食正常，飲水量多，大小便正常。由此可見，小柴胡湯及加味小柴胡湯80g/kg/d劑量可能對(duì)小鼠影響較大，而40g/kg/d劑量下對(duì)小鼠可能影響較小，故本課題以下實(shí)驗(yàn)所用劑量均在40g/kg/d劑量范圍以下進(jìn)行。 3.2兩種小柴胡湯對(duì)刀豆蛋白A

14、所致肝損傷的保護(hù)作用：小鼠從尾靜脈注射ConA造模后，模型組血清TNF-α及IFN-γ水平顯著升高，與血清轉(zhuǎn)氨酶ALT及AST活性升高水平同步，并與肝損傷病理改變程度相一致，肝組織學(xué)檢查，證實(shí)肝細(xì)胞損傷為肝細(xì)胞變性、壞死。 3.3加味小柴胡湯對(duì)醋氨酚所致肝損傷的保護(hù)作用：加味小柴胡湯大劑量及中劑量對(duì)大劑量醋氨酚所誘導(dǎo)的化學(xué)性肝損傷明顯的保護(hù)作用，能顯著降低LPO水平，升高GSH水平，可能與抗氧自由基,抑制脂質(zhì)過氧化，誘導(dǎo)肝藥酶活

15、性，促進(jìn)肝藥酶對(duì)毒物的代謝和解毒能力等有關(guān)。 3.4加味小柴胡湯對(duì)D一氨基半乳糖所致肝損傷的保護(hù)作用：加味小柴胡湯對(duì)D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型，具有明顯的保護(hù)作用，能顯著增強(qiáng)SOD活力，降低MDA的水平，肝組織病理變化減輕，說明加味小柴胡湯的保肝機(jī)制與其對(duì)抗自由基脂質(zhì)過氧化密切相關(guān)。 3.5加味小柴胡湯對(duì)酒精所致急性肝損傷的保護(hù)作用：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明攝入酒精后小鼠血清中MDA明顯增加，GSH含量明顯降低，而加味小

16、柴胡湯能明顯降低MDA，升高GSH，具有抗脂質(zhì)過氧化的能力，這些結(jié)果表明加味小柴胡湯的保肝作用與其抗氧化特性密切相關(guān)，它可能不僅是一個(gè)氧自由基的清除劑，還能夠抑制氧自由基的產(chǎn)生，并且能有效地改善小鼠酒精性肝損傷的病理變化。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，加味小柴胡湯能使小鼠Bax及Bcl-2的mRNA轉(zhuǎn)錄均上調(diào)，且使Bcl-2/Bax比值增高。加味小柴胡湯治療酒精性肝損傷小鼠，由于Bcl-2/Bax比值增高，提高了酒精性肝損傷小鼠肝組織抗凋亡作用。因此，

17、加味小柴胡湯可通過上調(diào)酒精性肝損傷小鼠肝組織Bcl-2/Bax比值，抑制細(xì)胞凋亡，減輕肝損傷。說明加味小柴胡湯可能通過上調(diào)Bcl-2鄺ax，抑制細(xì)胞內(nèi)通路(線粒體途徑)，減少細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮其保護(hù)肝損傷的作用。 4.結(jié)論4.1加味小柴胡湯對(duì)多種原因所致小鼠肝損傷有明顯的保護(hù)作用，且在刀豆蛋白A所致肝損傷模型中效果優(yōu)于小柴胡湯。加味小柴胡湯能通過顯著的降酶、抗氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化及調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫功能發(fā)揮其抗肝損傷作用。