煙草叢頂病毒RdRp介導(dǎo)的體外復(fù)制調(diào)控研究.pdf

1、煙草叢頂病毒（Tobacco bushy top virus,TBTV）為番茄叢矮病毒科（Tombusviridae）幽影病毒屬（Umbravirus）成員，與黃癥病毒科（Luteoviridae）的煙草扭脈病毒（Tobacco vein distorting virus, TVDV）復(fù)合侵染引起煙草叢頂病。TBTV基因組是一條（+）ssRNA，由4152個(gè)核苷酸組成，編碼4個(gè)開放閱讀框。ORF1編碼35 kDa的蛋白，ORF1的C端與

2、ORF2的N端有8個(gè)密碼子的重疊，ORF1蛋白通過-1位的移碼翻譯機(jī)制表達(dá)產(chǎn)生RdRp，為ORF1/ORF2融合蛋白形式。在對(duì)云南多地采集的煙草叢頂病毒進(jìn)化分析后發(fā)現(xiàn)，煙草叢頂病毒RdRp編碼區(qū)序列一致率相對(duì)較低，推測(cè)RdRp的活性變化可能導(dǎo)致病毒致病力的變化。
　　本研究旨在建立 TBTV RdRp介導(dǎo)的體外復(fù)制體系，并初步定位參與復(fù)制調(diào)控的RNA元件。首先通過重疊PCR擴(kuò)增得到煙草叢頂病毒中國分離物RdRp的編碼序列。構(gòu)建以p

3、MAL-C2X為基礎(chǔ)載體的原核表達(dá)載體pMAL-TB-RdRp。0.5 mM IPTG誘導(dǎo)可特異性表達(dá)分子量約為120 kDa的 MBP-RdRp融合蛋白。不同溫度條件下誘導(dǎo)MBP-RdRp，結(jié)果顯示，相比26℃和37℃，18℃下誘導(dǎo)表達(dá)的MBP-RdRp融合蛋白的可溶性比例較高，約17％；經(jīng)親和層析純化的MBP-RdRp可特異性識(shí)別TBTV正鏈和負(fù)鏈的3'末端序列，催化體外復(fù)制；并且對(duì)正負(fù)鏈的3'末端的體外復(fù)制效率存在差別，識(shí)別負(fù)鏈3

4、'末端的體外復(fù)制效率明顯高于正鏈3'末端。說明TBTV RdRp介導(dǎo)的特異性體外復(fù)制的建立。同時(shí)，結(jié)合RNA結(jié)構(gòu)體外分析構(gòu)建了3'UTR區(qū)的部分突變體，根據(jù)體外復(fù)制效率的變化初步定位了參與復(fù)制調(diào)控的RNA元件。
　　同時(shí)，構(gòu)建了不同分離物TB-JC，TB-MDI，TB-MDII的RdRp的原核表達(dá)載體，并初步驗(yàn)證了純化的不同分離物RdRp的體外復(fù)制活性。為將來進(jìn)行不同TBTV分離物RdRp的活性比較并定位關(guān)鍵氨基酸突變奠定了基礎(chǔ)。