偽狂犬病毒TK--GFP突變株與gB，gD內(nèi)吞基序突變體構(gòu)建以及Tn7介導(dǎo)的Bac-to-Bac系統(tǒng)的建立.pdf

1、偽狂犬病毒(pseudorabies vims，PRV)是引起多種家畜和野生動(dòng)物偽狂犬病的病原體。PRV屬皰疹病毒科，a皰疹病毒亞科，基因組為約150 kb的線性雙鏈DNA。PRV具有宿主范圍廣、不感染人、可供外源基因插入或替代的非必需基因位點(diǎn)多以及插入外源基因容量大等特點(diǎn)，在構(gòu)建動(dòng)物病毒載體方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。缺失PRV毒力基因，將外源保護(hù)性抗原基因插入PRV基因組表達(dá)，構(gòu)建基因工程缺失疫苗和多價(jià)疫苗是目前偽狂犬病防治研究的熱點(diǎn)。目前P

2、RV疫苗存在的一個(gè)問題就是，盡管可以抑制疾病的爆發(fā)，但是不能抵抗病毒的感染，所以免疫之后的家畜仍然可以攜帶并傳播病毒。這主要是由于PRV在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了多種逃避宿主免疫系統(tǒng)的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，作為疫苗開發(fā)中主要抗原的gB和gD蛋白在病毒免疫逃逸過程中具有重要的促進(jìn)作用，這包括兩個(gè)方面：(1)gB和gD都可以促進(jìn)抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞表面的病毒糖蛋白的內(nèi)吞作用；(2)gB還促進(jìn)了病毒在細(xì)胞間的直接傳播。上述功能的發(fā)揮與其胞內(nèi)區(qū)含酪氨酸的基序

3、YXXФ密切相關(guān)，該結(jié)構(gòu)的突變可使其喪失以上功能。另外，PRV也是皰疹病毒的—個(gè)重要模式病毒。PRV功能基因組學(xué)的研究對(duì)理解皰疹病毒復(fù)制和致病的機(jī)理具有重要意義。然而，由于皰疹病毒結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的遺傳學(xué)研究相當(dāng)困難。細(xì)菌人工染色體(bacterial artificialchromosome，BAC)技術(shù)為皰疹病毒等的遺傳學(xué)研究開辟了新的道路，使得對(duì)病毒基因組進(jìn)行系統(tǒng)的遺傳學(xué)分析成為可能。盡管如此，含有皰疹病毒的基因組的BA

4、C往往很大，不能采用酶切、連接等常規(guī)的技術(shù)操作，所以基因工程改造仍然相當(dāng)困難。 本研究分為以下三個(gè)方面： 首先，為了構(gòu)建PRVTK-/GFP突變體，首先提取偽狂犬病毒(PRV)湖北株基因組DNA為PCR擴(kuò)增模板，并根據(jù)GenBank已發(fā)表的基因序列，選擇保守序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，分別擴(kuò)增出位于UL23分別擴(kuò)增出位于UL23即胸苷激酶(Thymidine Kinase TK)兩側(cè)(含部分TK基因)的可用于同源重組的上游同源臂

5、和下游同源臂，上游同源臂長(zhǎng)度為1781bp包括部分UL25、全部UL24、部分TK，下游同源臂長(zhǎng)度為包括部分TK及部分UL22，上游同源臂和下游同源臂的拼接片段中TK基因內(nèi)部缺失842個(gè)核苷酸。將兩個(gè)同源臂克隆于pBluescriptSK+載體上，獲得pSK-1781-1968；再將綠色熒光蛋白載體pEGFP-N1上含GFP完整的基因表達(dá)盒插入pSK-1781-1968的上游同源臂和下游同源臂之間構(gòu)成轉(zhuǎn)移載體pSKAaXG。提取pSKA

6、aXG質(zhì)粒，經(jīng)單酶切線性化后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后，再以10MOI的野生型PRV進(jìn)行感染。過夜培養(yǎng)之后在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入5-溴脫氧尿嘧啶(BrdU)篩選的重組病毒。最后通過蝕斑純化獲得PRVTK-/GFP突變株。依據(jù)缺失區(qū)域兩側(cè)序列設(shè)計(jì)引物，PCR結(jié)果證實(shí)了TK的缺失與GFP表達(dá)盒的插入。這為進(jìn)一步開發(fā)病毒疫苗載體提供了基礎(chǔ)。 其次，為了研究gB和gD胞內(nèi)區(qū)YXXФ基序的功能以及對(duì)這兩種抗原免疫效果的影響，首先

7、設(shè)計(jì)兩對(duì)引物分別擴(kuò)增出PRV湖北株的gB和gD基因，并克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1+上。測(cè)序結(jié)果顯示gB基因全長(zhǎng)為2751 bp編碼916個(gè)氨基酸，gD基因全長(zhǎng)為1209 bp編碼402個(gè)氨基酸。然后依據(jù)測(cè)序結(jié)果，再設(shè)計(jì)針對(duì)胞內(nèi)區(qū)YXXФ中基序的突變引物，通過PCR或重疊PCR獲得gB和gD基因的YXXФ基序突變體，并將各突變體克隆到pcDNA3.1+上。通過酶切和測(cè)序證實(shí)獲得了與預(yù)期相同的突變體。這為進(jìn)一步研究gB，gD YXX

8、Ф基序在免疫逃逸中的作用，以及開發(fā)更加有效的疫苗奠定了基礎(chǔ)。 最后，為了利用Tn7介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座快速構(gòu)建重組PRV，首先設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別擴(kuò)增出上游同源臂和下游同源臂，克隆至pBluescript SK+載體匕，然后將lacZ α-mini-attTn7插入兩同源臂之間，獲得轉(zhuǎn)移載體。在大腸桿菌內(nèi)，通過同源重組將lacZ α-mini-attTn7插入偽狂犬病毒(PRV)細(xì)菌人工染色體(BAC)gG與gD基因間的非轉(zhuǎn)錄區(qū)，獲得重組B

9、AC pBeckerZF1。測(cè)序結(jié)果顯示lacZ α-mini-attTn7插入位點(diǎn)位于gG基因的polyA轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)下游44 bp，以及gD基因的TATA轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)上游23 bp處，不造成任何病毒基因和功能元件的破壞。然后利用Tn7介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座將綠色熒光蛋白基因?qū)雙BeckerZF1的mini-attTn7位點(diǎn)獲得了pBeckerZF2。通過轉(zhuǎn)染將pBeckerZF1和pBeckerZF2分別導(dǎo)入PK15細(xì)胞獲得重組病毒vBeck