清肝化淤方劑肝癌患者含藥血清對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞作用的基因芯片分析.pdf

1、目的:原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一,死亡率占第二位。中醫(yī)中藥在肝癌的治療中有重要作用。姚樹坤教授根據(jù)中醫(yī)傳統(tǒng)理論和近十年的臨床研究,以清熱解毒、破瘀散結(jié)、健脾益氣為治法,針對大多數(shù)患者的中醫(yī)證型,研制成清肝化瘀方劑,從臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗證實(shí)對肝癌前病變及癌變有明顯的阻斷作用。從癌基因、抑癌基因、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和免疫機(jī)制等多角度綜合研究清肝化瘀方劑的作用機(jī)理,表明清肝化瘀方劑多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)分子網(wǎng)絡(luò)的作用機(jī)理,豐富與完善了中藥抗癌研究

2、的理論體系。血清藥理學(xué)的研究方法是中藥復(fù)方體外實(shí)驗新興的一種方法,由于它同用中藥粗制劑直接進(jìn)行的體外實(shí)驗相比,既具有體外實(shí)驗條件可控性強(qiáng)、藥物效應(yīng)易于檢測、可深入揭示藥物作用機(jī)理的優(yōu)點(diǎn),是近年來中藥藥效學(xué)研究的重要方法?；蛐酒夹g(shù)可以在全基因組范圍內(nèi)同時分析待測樣本中成千上萬個基因的表達(dá)情況及其相互關(guān)系,揭示基因網(wǎng)絡(luò)的相互作用,具有快速、平行、高效、高通量地分析生物信息的特點(diǎn)。在中藥的研究中是一種可以揭示其多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)分子網(wǎng)絡(luò)作用機(jī)

3、制的可信的、新興的試驗方法。本實(shí)驗采用血清藥理學(xué)與基因芯片技術(shù)相結(jié)合的方法,通過基因芯片上的32050個探針組檢測了人肝癌SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)過未服藥肝癌患者血清、服用清肝化瘀方劑6周的肝癌患者含藥血清分別經(jīng)過加熱法和丙酮處理法處理后培養(yǎng)48小時后全基因組基因的表達(dá)差異,尋找參與清肝化淤方劑抗腫瘤作用的基因,在基因組學(xué)水平探討中藥抗腫瘤的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)。體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株SMMC-

4、7721,SMMC-7721細(xì)胞貼壁生長于含10％小牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100mg/ml的DMEM培養(yǎng)液中,置于37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～4天傳代一次,取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗。
　　 2肝癌患者血清的預(yù)處理。將服藥前肝癌患者血清及口服清肝化淤方劑6周的肝癌患者含藥血清分別用以下方法處理:(1)加熱法:血清置于56℃水浴30min;(2)丙酮法:血清加4倍體積的丙酮混勻,3000rpm,離心10min

5、,取上清液置于37℃恒溫水浴箱蒸發(fā),除去丙酮。
　　 3用經(jīng)過預(yù)處理的血清培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721并抽提RNA。將服藥前和服藥后6周的患者血清分別應(yīng)用加熱法和丙酮法進(jìn)行預(yù)處理并加入培養(yǎng)瓶,使其濃度為15％。培養(yǎng)48小時后,棄培養(yǎng)液,PBS液沖洗兩遍,應(yīng)用0.25％胰酶消化,用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化,加PBS液吹打成細(xì)胞懸液,移入無Rnase的EP管離心,棄上清,冰盒預(yù)冷,每支EP加入TRIZOL試劑1

6、ml,吹打數(shù)次,封口,標(biāo)記,-70℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 4將提取的細(xì)胞RNA,進(jìn)行Phalanx人表達(dá)譜芯片分析,基因芯片雜交步驟按照上?？党蓪?shí)驗室表達(dá)譜芯片實(shí)驗操作流程進(jìn)行,并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。
　　 結(jié)果:
　　 1差異表達(dá)的基因。(1)丙酮處理與加熱處理相比:服藥前血清培養(yǎng)的細(xì)胞差異表達(dá)的基因有3250個,其中上調(diào)2倍及2倍以上的有1555個,占基因總數(shù)的4.85％;表達(dá)下調(diào)2及2倍以上的有1695個,占基

7、因總數(shù)的5.29％。服藥后6周血清培養(yǎng)的細(xì)胞異表達(dá)的基因有2823個,其中上調(diào)2倍及2倍以上的有1395個,占基因總數(shù)的4.35％;表達(dá)下調(diào)2倍及2倍以上的有1428個,占基因總數(shù)的4.46％。
　　 (2)用藥后6周血清與用藥前血清相比:經(jīng)過加熱處理培養(yǎng)的細(xì)胞差異表達(dá)的基因有2880個,其中上調(diào)2倍及2倍以上的有1487個,占基因總數(shù)的4.64％;表達(dá)下調(diào)2倍及2倍以上的有1393個,占基因總數(shù)的4.35％。經(jīng)過丙酮處培養(yǎng)的細(xì)

8、胞差異表達(dá)的基因有2314個,其中上調(diào)2倍及2倍以上的有1128個,占基因總數(shù)的3.52％;表達(dá)下調(diào)2倍及2倍以上的有1186個,占基因總數(shù)的3.70％。
　　 2差異基因的功能分類:服藥后血清經(jīng)過丙酮處理與加熱處理相比,上調(diào)的基因主要與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)。下調(diào)的基因主要與物質(zhì)代謝、細(xì)胞增殖有關(guān)。
　　 加熱處理的服藥后血清與服藥前血清相比,上調(diào)的基因主要與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、抑癌基因、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫功

9、能有關(guān)。下調(diào)的基因主要與癌基因、細(xì)胞增殖、物質(zhì)和能量代謝、細(xì)胞生長有關(guān)。
　　 3服藥后6周血清與服藥前血清相比,顯著上調(diào)的基因有PDCD8、TGFB1、MAP4K3、BTG1、CDKN3、OVOL1等,顯著下調(diào)的基因有IRAK2、RHOA、DEAF1、IGFBP2、BAD等,主要與細(xì)胞增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞凋亡、抑癌基因有關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1清肝化瘀方劑肝癌患者服藥6周的含藥血清,可影響人肝癌SMMC