2型糖尿病大鼠心肌纖維化的炎癥機制及阿托伐他汀、羅格列酮及二者聯(lián)合對心肌的保護作用.pdf

1、糖尿病心肌病是一種獨立的糖尿病心血管并發(fā)癥，與糖尿病患者的高心力衰竭發(fā)生率和高死亡率密切相關。本研究通過高糖，高脂飲食加腹腔注射小劑量STZ的方法，制成2型糖尿病大鼠模型。我們選擇目前廣泛應用于臨床的噻唑烷二酮類藥物-羅格列酮(Rosiglitazone，Rsg)和他汀類藥物一阿托伐他汀(Atorvastatin，Ato)，觀察它們對該模型心肌組織中炎癥細胞浸潤程度、炎癥因子、NF-κB/IκB通路、TGF-β1/Smad通路及膠原代謝

2、的影響。 第一部分阿托伐他汀、羅格列酮及二者聯(lián)合對2型糖尿病大鼠心肌的保護作用 目的：了解阿托伐他汀和羅格列酮是否對2型糖尿病大鼠心肌膠原堆積產生影響，探討阿托伐他汀、羅格列酮及二者聯(lián)合是否對2型糖尿病大鼠心肌有保護作用。 方法：用成年SD大鼠，通過高糖，高脂飲食加腹腔注射小劑量STZ的方法，制成2型糖尿病大鼠模型。采用光鏡、電鏡觀察對照組、糖尿病組大鼠心臟的形態(tài)學改變以確定模型建立情況及炎癥細胞浸潤程度，用Ma

3、sson三色染色觀察心肌膠原沉積情況，生化法檢測心肌羥脯氨酸含量以確定心肌膠原蛋白含量。用Western blot技術檢測大鼠心肌MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表達，用RT-PCR檢測MMP-2、MMP-9、TIMP-1mRNA水平，用免疫組化法檢測Ⅰ型、Ⅲ型膠原及MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表達和組織定位。 12w時開始分成阿托伐他汀(20mg/kg/d)組、羅格列酮(2mg/kg/d)組及阿托伐他汀加羅

4、格列酮組，用上述藥物給大鼠每天一次灌胃至實驗結束(干預12w)，觀察藥物對上述指標的變化。 結論：阿托伐他汀及羅格列酮可減輕糖尿病大鼠心肌組織炎癥細胞浸潤和膠原沉積，改善糖尿病大鼠心肌MMPs/TIMPs平衡，減輕糖尿病心肌病變的嚴重程度。阿托伐他汀聯(lián)合羅格列酮可提高抗炎、抗纖維化程度。 第二部分炎癥因子與2型糖尿病大鼠心肌膠原代謝的關系及阿托伐他汀、羅格列酮干預研究 目的：觀察實驗性2型糖尿病大鼠心肌膠原的積聚

5、情況與血漿、心肌TNF-α、IL-6、脂聯(lián)素、CRP和Ang Ⅱ、Aid的變化及其關系，了解阿托伐他汀、羅格列酮對它們的影響。 方法：采用放免法檢測血漿和心肌局部TNF-α、IL-6及Ang Ⅱ、Ald的含量；應用ELISA法檢測血漿和心肌中脂聯(lián)素、hs-CRP的含量。 結果： 1.癥狀、體征、生化指標的改變：HE染色結果；超微結構的改變；Masson染色結果；心肌組織羥脯氨酸含量：均同第一部分。 2.D

6、M大鼠血漿、心肌hs-CRP、TNF-α、IL-6及Ang Ⅱ、Ald的含量明顯高于對照組大鼠(p<0.001)，羅格列酮及阿托伐他汀治療組血漿、心肌 hs-CRP、TNF-α、IL-6及Ang Ⅱ、Ald的含量較同期。DM大鼠均顯著下降(p<0.01)，且雙藥組較單藥組降低更明顯(p<0.01)；DM大鼠血漿、心肌Adi含量明顯低于對照組大鼠(p<0.001)，羅格列酮及阿托伐他汀治療組血漿、心肌脂聯(lián)素含量較同期DM大鼠均顯著升高(p

7、<0.01)，且雙藥組較單藥組升高更明顯(p<0.01)。 3.心肌膠原含量與CRP、TNF-α、IL-6、脂聯(lián)素、Ang Ⅱ、Ald相關分析表明：心肌局部CRP、TNF-α、Ang Ⅱ、Ald、IL-6含量與心肌膠原面密度(r=0.623、0.679、0.622、0.684，p<0.01；0.535，p<0.05)呈正相關，脂聯(lián)素與膠原面密度(r=-0.562，p<0.05)呈負相關。 結論：DM大鼠無論血漿中還是心肌

8、組織中致炎因子CRP、IL-6、TNF-α增多，抗炎因子脂聯(lián)素減少，表明炎癥參與了DM心肌病變的發(fā)生與發(fā)展。DM大鼠心肌組織局部AngⅡ、Ald明顯增高，表明心肌中RAAS激活參與了DM心肌病變的發(fā)生與發(fā)展。阿托伐他汀和羅格列酮可通過抑制炎癥因子及RAAS激活，增加抗炎因子，使糖尿病大鼠心肌組織膠原沉積和纖維化程度明顯減輕，延緩糖尿病心肌病變的進程。阿托伐他汀聯(lián)合羅格列酮可提高抗炎、抗纖維化程度。 第三部分阿托伐他汀、羅格列酮及

9、二者聯(lián)合對2型糖尿病大鼠心肌NF-κB/IκB信號轉導通路的影響 目的：了解NF-κB/IκB通路在糖尿病大鼠心肌中的表達及阿托伐他汀、羅格列酮對它的干預作用。 方法：用Western blot技術檢測大鼠心肌TNF-α、NF-κB亞單位P65、阻抑物IκBa蛋白的表達，用RT-PCR檢測NF-κB、TNF-α mRNA水平，用免疫組化法檢測上述蛋白表達和組織定位。 結論：NF-κB/IκB通路在糖尿病大鼠心肌中

10、被激活，從而參與糖尿病心肌病變的發(fā)病。阿托伐他汀和羅格列酮可通過抑制糖尿病大鼠心肌NF-κB/IκB信號轉導通路的激活，減輕糖尿病大鼠心肌組織膠原沉積和纖維化程度，從而延緩糖尿病心肌病變的進展。兩藥聯(lián)合應用對NF-κB/IκB通路的干預作用具有疊加效應。 第四部分TGF-β1/Smad信號轉導通路在2型糖尿病大鼠心肌病變中的表達及阿托伐他汀、羅格列酮干預研究 目的：觀察2型DM大鼠心肌纖維化形成過程中TGF-β1/Sma

11、d信號通路的變化及阿托伐他汀、羅格列酮對它的干預作用。 方法：用RT-PCR檢測TGF-β1、c-fos mRNA表達，用Western blot技術檢測大鼠心肌TGF-β1、Smad2/3、Smad7、c-fos的表達，用免疫組化法檢測上述蛋白表達及組織定位。 結果： 1.癥狀、體征、生化指標的改變：HE染色結果；超微結構的改變；Masson染色結果；心肌組織羥脯氨酸含量：均同第一部分。 2.阿托伐他汀

12、、羅格列酮及二者聯(lián)合對2型DM大鼠心肌組織TGF-β1、c-fos mRNA表達的影響：糖尿病組大鼠心肌組織中TGF-β1、c-fos mRNA表達水平較對照組明顯增加(p<0.01)，阿托伐他汀和羅格列酮干預組較糖尿病組TGF-β1、c-fosmRNA表達水平明顯減低(p<0.01)，兩種藥物干預組相比，無統(tǒng)計學差異，但雙藥組較單藥組降低更明顯(p<0.01)。 3.阿托伐他汀、羅格列酮及二者聯(lián)合對2型DM大鼠心肌組織TGF-

13、β1蛋白表達的影響：免疫組化顯示：TGF-β1在對照大鼠成纖維細胞、血管內皮細胞和心肌細胞均有表達，但DM大鼠陽性染色光密度值明顯高于同期對照大鼠的光密度值(p<0.01)，阿托伐他汀和羅格列酮干預后TGF-β1蛋白水平明顯下降(p<0.01)，兩種藥物干預組相比，無統(tǒng)計學差異，但雙藥組較單藥組降低更明顯(p<0.01)。用Western Blot檢測也得到相同結果。 4.阿托伐他汀、羅格列酮及二者聯(lián)合對2型DM大鼠心肌組織Sm

14、ad2/3蛋白表達的影響：免疫組化顯示：Smad2/3在DM大鼠心肌中的表達明顯升高(p<0.01)，阿托伐他汀和羅格列酮干預后Smad2/3蛋白水平明顯下降(p<0.01)，兩種藥物干預組相比，無統(tǒng)計學差異，但雙藥組較單藥組降低更明顯(p<0.01)。 Western Blot結果顯示：DM大鼠心肌Smad2/3蛋白水平與同期正常對照大鼠比較明顯升高(p<0.01)，藥物干預后Smad2/3蛋白水平明顯下降(p<0.01)，且

15、雙藥組較單藥組降低更明顯(p<0.01)。 5.阿托伐他汀、羅格列酮及二者聯(lián)合對2型DM大鼠心肌組織Smad7蛋白表達的影響：免疫組化顯示：Smad7在DM大鼠心肌中的表達明顯降低(p<0.01)，阿托伐他汀和羅格列酮干預后Smad7蛋白水平明顯升高(p<0.01)，兩種藥物干預組相比，無統(tǒng)計學差異，但雙藥組較單藥組升高更明顯(p<0.01)。用Western Blot檢測也得到相同結果。 6.阿托伐他汀、羅格列酮及二者

16、聯(lián)合對2型DM大鼠心肌組織c-fos蛋白表達的影響：免疫組化顯示：c-fos在DM大鼠心肌中的表達明顯升高(p<0.01)，阿托伐他汀和羅格列酮干預后c-fos蛋白水平明顯下降(p<0.01)，兩種藥物干預組相比，無統(tǒng)計學差異，但雙藥組較單藥組降低更明顯(p<0.01)。 Western Blot結果顯示：DM大鼠心肌c-fos蛋白水平與同期正常對照大鼠比較明顯升高(p<0.01)，藥物干預后c-fos蛋白水平明顯下降(p<0.

17、01)，且雙藥組較單藥組降低更明顯(p<0.01)。 7.心肌膠原纖維的含量與TGF-β1、c-fos的關系：以膠原面密度為因變量，TGF-β1、c-fos(Western灰度積分光密度值)為自變量，進行直線相關分析，顯示心肌膠原含量與TGF-β1、c-fos表達呈正相關，相關系數(shù)為0.542；0.507(p<0.05)。 8.c-fos與NF-κB、TGF-β1的相關性分析：以c-fos(Western灰度積分光密度值

18、)為因變量，NF-κB、TGF-β1為自變量，進行直線相關分析，顯示c-fos與NF-κB、TGF-β1均呈正相關，相關系數(shù)分別為0.955；0.924，(p<0.01)。 結論：DM大鼠心肌組織TGF-β1及Smad2/3的mRNA和蛋白表達明顯增高，說明糖尿病心肌病的病理改變與TGF-β1系統(tǒng)啟動有關。阿托伐他汀和羅格列酮可抑制糖尿病大鼠心肌TGF-β1/Smad通路。阿托伐他汀和羅格列酮可下調糖尿病大鼠心肌c-fos mR