博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化初期肺動脈壁CTGF的表達(dá)及羅格列酮的影響.pdf

1、目的：肺動脈高壓是肺纖維化的常見并發(fā)癥。本室以往的研究已發(fā)現(xiàn)，在氣管內(nèi)滴注BLM14天，模型大鼠出現(xiàn)肺動脈高壓，但其形成機(jī)制，目前尚不清楚。肺動脈壁膠原沉積是肺動脈高壓維持發(fā)展的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。結(jié)締組織生長因子是直接促進(jìn)膠原纖維沉積的細(xì)胞因子。羅格列酮是過氧化物酶體增殖活化受體γ的激動劑，本室以往研究發(fā)現(xiàn)，RSG具有緩解BLM誘導(dǎo)的肺動脈高壓的作用，但其作用機(jī)制，尚不清楚。本研究通過整體和離體實(shí)驗(yàn)觀察氣管內(nèi)滴注BLM后第14天，大鼠肺動脈

2、壁平滑肌層Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維含量的變化、肺動脈壁內(nèi)皮層和平滑肌層CTGF的表達(dá)以及RSG對上述變化的影響，以闡明肺纖維化初期肺動脈高壓形成及RSG抗肺動脈高壓的作用機(jī)制，并為尋找其治療靶點(diǎn)及藥物提供實(shí)驗(yàn)資料。
　　 第一部分博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化初期肺動脈壁CTGF的表達(dá)
　　 方法：采用天狼星紅染色法，觀察氣管內(nèi)滴注BLM14天，大鼠肺動脈主干及肺內(nèi)動脈壁Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的變化；并用免疫組織化學(xué)染色，觀察大鼠肺動脈主干及肺

3、內(nèi)動脈壁CTGF表達(dá)及其分布的變化。
　　 健康清潔級Sprague-Dawley雄性大鼠12只，隨機(jī)分為兩組：①Control組：一次性氣管內(nèi)滴入生理鹽水；②BLM組：一次性氣管內(nèi)滴入BLM。
　　 兩組大鼠分別于造模后第14天取材。經(jīng)頸動脈放血處死動物，用4％多聚甲醛溶液固定肺動脈主干及部分左肺組織。固定后的組織經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后切片，用于天狼星紅染色和免疫組織化學(xué)染色。JEDA-801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分別

4、計算肺動脈壁Ⅰ、Ⅲ型膠原天狼星紅染色的陽性面積百分比、CTGF免疫組織化學(xué)染色陽性的平均光密度值及陽性面積百分比。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為有顯著性差異。
　　 結(jié)果：1.滴注BLM大鼠肺動脈主干Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的變化滴注BLM大鼠肺動脈主干血管壁Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維染色面積與Control組相比均明顯增多；Ⅰ、Ⅲ型膠原染色面積比值與Control組相比增

5、大；Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維的增多突出表現(xiàn)為平滑肌層，尤其Ⅰ型膠原纖維增多更為明顯。
　　 2.滴注BLM大鼠肺內(nèi)動脈壁Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的變化滴注BLM大鼠肺內(nèi)動脈壁Ⅰ、Ⅲ型膠原染色面積與Control組相比均明顯增多；但BLM大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原染色面積比值與Control組相比，其差異卻無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3.滴注BLM后大鼠肺動脈主干CTGF含量的變化滴注BLM大鼠肺動脈主干CTGF免疫陽性表達(dá)與Control組相比明顯增

6、多，而BLM組增多主要在平滑肌層。
　　 4.滴注 BLM后大鼠肺內(nèi)動脈壁CTGF含量的變化滴注BLM大鼠肺內(nèi)動脈壁內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞CTGF的免疫陽性表達(dá)與Control組大鼠相比也明顯增多。
　　 小結(jié)：氣管內(nèi)滴入BLM14天，大鼠肺動脈壁平滑肌層Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維的含量明顯增多；肺動脈壁平滑肌層和內(nèi)皮層CTGF的表達(dá)也明顯增加。這可能是BLM致肺纖維化初期肺動脈高壓維持和發(fā)展的重要機(jī)制之一。
　　 第二部分羅格

7、列酮對博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化初期肺動脈壁CTGF表達(dá)的影響
　　 方法：采用與第一部分相同的方法，觀察RSG對肺動脈壁Ⅰ、Ⅲ型膠原和CTGF表達(dá)變化的影響。
　　 健康清潔級Sprague-Dawley雄性大鼠36只，隨機(jī)分為四組：①NS+NS組：一次性氣管內(nèi)滴入生理鹽水，NS灌胃14天；②BLM+NS組：一次性氣管內(nèi)滴入BLM，NS灌胃14天；③BLM+RSG組：一次性氣管內(nèi)滴入BLM，RSG灌胃14天；④NS+RSG組

8、：一次性氣管內(nèi)滴入生理鹽水，RSG（灌胃14天。
　　 四組大鼠分別于造模后第14天取材。其中，BLM+NS組有6只大鼠肺動脈取出后立即被置于4％多聚甲醛中固定，另外12只大鼠的肺動脈在體外孵育（DMEM培養(yǎng)液，37℃，5％CO2）24小時后被置于4％多聚甲醛溶液中固定。體外孵育分兩組：分別為單純培養(yǎng)液組（DMEM）和RSG孵育組（DMEM中含RSG10μmmol/L），每組6只大鼠。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表達(dá)，采用

9、SPSS13.0統(tǒng)計軟件，整體給藥數(shù)據(jù)用單因素方差分析，多個樣本均數(shù)間的兩兩比較用最小顯著差法（LSD），離體給藥數(shù)據(jù)采用兩樣本均數(shù)比較t檢驗(yàn)，以P<0.05為有顯著性差異。
　　 結(jié)果：1、RSG對滴注BLM后大鼠肺動脈主干Ⅰ、Ⅲ型膠原含量變化的影響NS+NS組大鼠肺動脈主干平滑肌層有少量Ⅰ、Ⅲ型膠原。NS+NS組，NS+RSG組，大鼠肺動脈壁平滑肌層Ⅰ、Ⅲ型膠原染色面積及Ⅰ、Ⅲ型膠原染色面積比值分別為（2.35±0.46，0

10、.33±0.02，7.12±0.92）；（2.42±0.37，0.35±0.02，7.29±0.92）。兩組相比，其差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。BLM+NS組肺動脈壁Ⅰ、Ⅲ型膠原染色面積及Ⅰ、Ⅲ型膠原染色面積比值分別為（4.56±0.63，0.51±0.07，9.21±0.89）均明顯多于NS+NS組（P<0.05）。BLM+RSG組肺動脈壁Ⅰ、Ⅲ型膠原染色面積及Ⅰ、Ⅲ型膠原染色面積比值分別為（2.33±0.49，0.34±0.

11、02，6.78±1.07），與BLM+NS組相比均明顯減少（P<0.05）。離體水平RSG孵育組（DMEM中含RSG10μmmol/L）肺動脈壁Ⅰ、Ⅲ型膠原染色面積（7.39±0.51，2.32±0.26）與單純DMEM孵育組（7.74±1.83，2.08±0.37）相比，其差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　 2、RSG對滴注BLM后大鼠肺內(nèi)動脈壁Ⅰ、Ⅲ型膠原含量變化的影響NS+NS組大鼠肺內(nèi)動脈壁平滑肌層有少量Ⅰ、Ⅲ型

12、膠原纖維；NS+RSG組肺動脈壁Ⅰ、Ⅲ型膠原染色面積分別為（1.99±0.14，1.06±0.12），與NS+NS組（1.86±0.52，1.05±0.14）相比，其差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。BLM+NS組肺動脈壁Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維染色面積分別為（4.58±0.67，2.23±0.25），與NS+NS組相比均顯著增多（P<0.01）。BLM+RSG組肺動脈壁Ⅰ、Ⅲ型膠原染色面積分別為（1.85±0.16，0.99±0.12），與

13、BLM+NS組相比均明顯減少（P<0.01）。NS+NS組、BLM+NS組、BLM+RSG組、NS+RSG組肺內(nèi)動脈壁Ⅰ、Ⅲ型膠原染色面積比值分別為（2.03±0.51）、（2.32±0.68）、（2.06±0.15）和（1.98±0.07），BLM+NS組與其他三組比較偏高些，但四者相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　 3、RSG對滴注BLM14天后大鼠肺動脈主干CTGF含量變化的影響NS+NS組大鼠肺動脈壁各層均有少量C

14、TGF免疫陽性表達(dá)的細(xì)胞。NS+RSG組大鼠肺動脈壁內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞CTGF免疫陽性表達(dá)（平均光密度0.33±0.01，陽性面積1.26±0.39）與NS+NS組（平均光密度0.32±0.03，陽性面積1.38±0.43）相比，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。而BLM+NS組（平均光密度0.41±0.02，陽性面積8.79±1.17）明顯強(qiáng)于NS+NS組（P<0.05）。BLM+RSG組（平均光密度0.33±0.04，陽性面積1

15、.23±0.52）明顯弱于BLM+NS組（P<0.05），但與NS+NS組、NS+RSG組相比大鼠肺動脈壁內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞CTGF的表達(dá)變化不明顯（P>0.05）。離體水平RSG孵育組（DMEM中含 RSG10μmmol/L）肺動脈壁CTGF免疫陽性表達(dá)（平均光密度0.30±0.01，陽性面積1.78±0.26）弱于單純DMEM孵育組（平均光密度0.36±0.02，陽性面積5.16±1.14）（P<0.05）。
　　 4、R

16、SG對滴注BLM后大鼠肺內(nèi)動脈壁CTGF含量變化的影響NS+NS組肺內(nèi)動脈壁有少量CTGF的表達(dá)（平均光密度0.30±0.02，陽性面積1.08±0.32）。與NS+NS組相比，NS+RSG組大鼠肺內(nèi)動脈壁平滑肌細(xì)胞CTGF的表達(dá)無明顯變化（平均光密度0.29±0.02，陽性面積0.99±0.21）（P>0.05）；BLM+NS組（平均光密度0.42±0.05，陽性面積12.1±1.87）明顯強(qiáng)于NS+NS組（P<0.05）。BLM+R

17、SG組（平均光密度0.28±0.01，陽性面積1.05±0.34）明顯弱于BLM+NS組（P<0.05），但與NS+NS組、NS+RSG組相比，其差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　 小結(jié)：整體給藥，RSG可降低BLM誘導(dǎo)的肺纖維化初期肺動脈壁平滑肌層Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維的含量，并抑制肺動脈壁平滑肌層和內(nèi)皮層CTGF的表達(dá)；離體給藥，RSG對肺動脈壁平滑肌層Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維的含量的影響不明顯，但可抑制肺動脈壁平滑肌層和內(nèi)皮層C

18、TGF的表達(dá)。這可能是RSG降低肺動脈高壓的機(jī)制之一。
　　 結(jié)論：1、氣管內(nèi)滴入BLM14天，大鼠肺動脈壁平滑肌層Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維的含量明顯增多，肺動脈壁平滑肌層和內(nèi)皮層CTGF的表達(dá)也明顯增加，這可能是BLM致肺纖維化初期肺動脈高壓維持和發(fā)展的重要機(jī)制之一。
　　 2、整體給藥，RSG可降低BLM誘導(dǎo)的肺纖維化初期肺動脈壁平滑肌層Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維的含量，并抑制肺動脈壁平滑肌層和內(nèi)皮層CTGF的表達(dá)；離體給藥，RSG對