中國野生華東葡萄白河-35-1抗白粉病PR10基因的克隆與表達分析.pdf

1、在前期的研究中，實驗室以多年鑒定為高抗白粉病的中國野生華東葡萄白河-35-1為材料，構(gòu)建了cDNA文庫，并測序獲得了與抗病有關(guān)的一些EST序列。本試驗是在此基礎(chǔ)上，對所獲得的病程相關(guān)蛋白基因(PR10)的EST序列進行進一步地研究，以闡明該病程相關(guān)蛋白基因的結(jié)構(gòu)，與其它物種中病程相關(guān)蛋白基因的同源關(guān)系，考察其拷貝數(shù)，表達特點及在葡萄抗白粉病過程中的表現(xiàn)，取得的主要研究結(jié)果有： 1．白河-35-1病程相關(guān)蛋白基因(VpPPR10)

2、cDNA及DNA序列的克隆和分析在已有PR10 EST、序列的基礎(chǔ)之上，設(shè)計特異引物，通過RACE技術(shù)，克隆獲得了華東葡萄白河-35-1 PR10基因的完整cDNA序列，長827 bp組成，暫命名為VpPR10。根據(jù)該完整序列的開放閱讀框區(qū)域設(shè)計引物，克隆獲得了VpPR10的部分DNA序列，長602 bp。兩條序列登錄GenBank．數(shù)據(jù)庫，登錄號分別為：DQ336289和DQ396808。序列分析表明，VpPR10基因序列除具有PRl

3、O基因普遍具有的Bet v1 family signature和P-loop模體外，還具有其它多個模體。序列比對表明，VpPR10蛋白序列與歐洲葡萄白玉霓的兩個PR10蛋白分別具有79％和89％的相似性，和毛葡萄的一個PR10蛋白具有96％的序列相似性，和華東葡萄的另外一個PR10蛋白具有98％的相似性。 2．白河-35-1病程相關(guān)蛋白基因(VpPR10)基因的Southem blot分析將白河-35-1基因組DNA分別用Eco

4、R I，HindlⅢ，Xba I三種限制性內(nèi)切酶進行單酶切，以獲得的VpPR10 DNA序列為探針，進行Southern blot分析。結(jié)果表明，在每個泳道上，至少有4條雜交帶，大小位于2.0至10.0 kb之間，因而VpPR10屬于一個多基因家族。對白河-35-2、廣西-2、湖南-1、玫瑰香、無核白、河岸葡萄和山平氏葡萄7個葡萄品種或株系的Southern blot分析表明，PR10基因在葡萄中均以多拷貝廣泛存在。 3．白河-

5、35-1病程相關(guān)蛋白基因(VpPR10)在mRNA水平的表達變化情況用實時熒光定量PCR技術(shù)，對對照及白粉菌接種后不同時間白河-35-1葉片中VpPR10在mRNA水平的表達變化情況進行分析。結(jié)果表明，在對照葉片中，VpPR10是組成性表達的，在接種過的葉片中，接種24 h后，VpPR10的表達量與對照相比稍微有所降低，在接種48和72 h后，VpPR10的表達量明顯降低，并在72 h時達到最低值。在接種96 h后，VpPR10的表達量

6、恢復(fù)到對照的水平。說明在白河-35-1抗白粉病的過程中，VpPR10在轉(zhuǎn)錄水平即受到調(diào)節(jié)，參與抗病反應(yīng)。 4．白河-35-l病程相關(guān)蛋白基因(VpPR10)的原核表達、重組蛋白的純化及多克隆抗體的制備將VpPR10的編碼序列與原核表達載體pGEX-4T-1連接，構(gòu)建重組表達載體。重組表達載體轉(zhuǎn)入宿主菌Ecoli BL21(DE3)后，用0.1 mM IPTG分別于30℃和37℃誘導(dǎo)3 h進行重組蛋白的表達，結(jié)果表明，重組蛋白在兩

7、種溫度下都能夠表達，但在30℃時大部分以可溶形式表達，在37℃時大部分以包涵體形式表達。 用O.1 mM的IPTG在30℃誘導(dǎo)3 h，使重組蛋白大部分以可溶形式表達。誘導(dǎo)后的菌體用細菌裂解液裂解后，收集可溶性蛋白，用GST親和樹脂進行純化。將純化后的重組蛋白免疫家兔制備了抗VpPR10融合蛋白的多克隆抗體。 5．白河-35-1葉片中病程相關(guān)蛋白(VpPR10)的表達變化情況用制備的多克隆抗體對對照及白粉菌接種后不同時間白

8、河-35-1葉片中VVpPR10蛋白的表達變化情況進行分析。結(jié)果表明該抗體能夠特異識別電泳遷移位置在17 kDa的蛋白，在未經(jīng)白粉菌誘導(dǎo)的葉片中，VpPR10蛋白的表達量較高；在經(jīng)白粉菌誘導(dǎo)后的葉片中，VpPR10蛋白的表達量在誘導(dǎo)24 h后僅有少量降低，但在誘導(dǎo)48 h和72 h后，VpPRl0蛋白的表達量迅速降低，僅能夠微弱地被檢測到。在誘導(dǎo)96 h后，VpPR10蛋白的表達量迅速恢復(fù)到了誘導(dǎo)24 h后的水平，之后又有所提高。這說明